Préparation et observation microscopique photonique

1. Techniques d’examens
microscopiques
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cours E. Grelier
Présentation sur la
microscopie photonique

2. I Méthodes d’étude de la
morphologie des cellules :
techniques d’examens
microscopiques
Préparation et observation
microscopique photonique.
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3. 3
Rappel: Schémas de principe du microscope photonique
Source de photons :
lampe
Condenseur
Lame support
objet transparent
Oeil
Oculaire
Objectif
Techniques d’examen microscopique
Microscopie photonique
Les échantillons biologiques observés
sont traversés par la lumière.
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4. 4
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à contraste de phase
Utilisation des différents
indices de réfraction des
milieux traversés par la
lumière pour contraster
les structures cellulaires
sans coloration.
Intérêt: possibilité
d’observer des cellules
vivantes et leur
mouvement en
microcinématographie
accélérée
Microscopie photonique
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5. 5
Utilisation des marqueurs
(fluorochromes : fluorescéine,
rhodamine) capables
- d’absorber un rayonnement de
faible longueur d’onde et de
forte énergie émis par une
source d’UV et
- d’émettre (par excitation) un
rayonnement de grande longueur
d’onde mais de faible énergie
dans le visible
- NB: chlorophylle par exemple ne
nécessite pas l’utilisation de
fluorochrome.
Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à épifluorescence
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Microscopie/fluo/fluo.htm
Observation de l’ADN avec un
microscope à épifluorescence
après utilisation de fluorochrome
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6. 6
Rappelez-vous : quel est l’impact de l’utilisation
d’UV plutôt que de la lumière blanche sur la limite
de résolution ?
Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à épifluorescence
Déductions théoriques Applications pratiques
Diminution de
d et
augmentation
de PR si
λ diminue, Microscope à épifluorescence
avec UV
n augmente, Utilisation de l’huile à immersion
a augmente Ouverture augmentée à la
construction
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7. 7
Un microscope à épifluorescence amélioré : le
microscope confocal
Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques :
le microscope à épifluorescence
Exploitation du principe de la fluorescence émise par plusieurs composés
excités par un rayonnement cohérent (LASER) qui balaye l’objet en largeur et
en profondeur : la détection de l’image sélectionnée par un filtre précis
(éliminant les émissions parasites) permet une reconstitution par ordinateur
d’images éventuellement en trois dimensions
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8.  L’observation par transmission exige que les
rayons lumineux traversent l’objet.
 Ainsi l’objet doit être de faible épaisseur
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- Techniques d’examen microscopique
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
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9. En salle de Tp vous réalisez:
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- Techniques d’examen microscopique
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
Fixation pour
consolider
Inclusion pour
durcir l’échantillon
Microtomie pour
couper
Coloration pour
le contraste
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10. Etape 1: la fixation
Elle peut être chimique:
avec des fixateurs
coagulants (pour les
tissus) ou non coagulants
(cytologie).
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Techniques d’examen microscopique
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
Elle peut être physique:
la congélation (qui doit
être rapide): c’est la
meilleure technique.
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11. Etape 2: l’inclusion
l'eau des cellules est remplacée
par de la paraffine chaude qui
durcit en refroidissant.
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- Techniques d’examen microscopique
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
NB: Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible:
ces deux liquides n'étant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau
des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène qui peut se mélanger à la
paraffine liquide chaude.
On peut aussi durcir avec la congélation.
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12. Etape 3: la coupe
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- Techniques d’examen microscopique.
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
On utilise un microtome : rasoir d’acier
Après inclusion à la paraffine : coupes de 2 à 5 μm,
Après congélation : coupes de 5-10 μm.
NB : Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le
microtome est équipé d'une enceinte maintenue à -20°C.
http://www.youtube.com/watch?v=1lY1CDKfj
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13. La coloration
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- Techniques d’examen microscopique
Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière
Colorants vitaux
Ils ne tuent pas les cellules mais sont
peu nombreux
Ex: rouge neutre
Colorants non vitaux
Ils tuent la cellule et nécessitent
une fixation de la cellule au
préalable.
cf Tp histologie
Observation de cellules d’oignons au microscope
photonique
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14. II. Méthodes d’étude de la
composition biochimique
des cellules
Exemples avec quelques
marquages cellulaires
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II Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 Elastine dans le derme
(Coloration de WEIGERT -
grossissement x 400)
http://bioimage.free.fr/his_image/elastique_1_10.htm
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II– Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 Réticuline dans les tubules
rénaux (coloration Gordon Sweets
x 250)
http://bioimage.free.fr/his_image/fibres_de_reticuline.htm
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II – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 Mucus : coupe de la muqueuse
oesophagienne (coloration PAS
x 100).
http://bioimage.free.fr/his_image/pas_glandes_muqueuses_oesophage_5.htm
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II – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 bronche tertiaire avec son
épithélium cylindrique cilié et
cellules caliciformes entouré de
tissu conjonctif et de fibres
musculaires lisses
Coloration Hémalun Phloxine Safran -
Grossissement x 200
http://bioimage.free.fr/his_image/bronches_200.htm
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II – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 frottis de sang d'anémie
sidéroblastique montrant un
sidéroblaste II (érythroblaste
acidophile possédant dans son
cytoplasme des grains
d'hémosidérine (molécule de
stockage du fer) car il ne peut
intégrer le fer dans
l'hémoglobine la coloration est
la coloration de Perls x 1000
http://bioimage.free.fr/hem_image/sidero8g.htm
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II – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
 frottis de leucémie aigue où les
blastes (cellules cancéreuses)
possèdent dans leurs
granulations de la
myéloperoxydase mise en
évidence par ajout d'un substrat
qui précipite sous forme de
grains bleus ce qui fait classer
le leucémie en LAM (leucémie
aiguë myéloblastique).
http://bioimage.free.fr/hem_image/peroxps7g.htm
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Granules sécrétoires de
cellules gastriques mis en
évidence par un anticorps
antigastrine reconnu par un
conjugué (anti Ig couplé à la
ferritine) MET
Glucagon mis en évidence dans
des cellules pancréatiques par
un anticorps antiglucagon
reconnu par un conjugué (anti
Ig couplé à l’or colloïdal) MET
Marquage spécifique par des conjugués (marqueurs fixés sur des anticorps)
Fuseau mitotique mis en évidence par un anticorps antitubuline
reconnu par un anticorps maqué à l’Alexa 488
Chromosome révélé en bleu par du DAPI (colorant spécifique des
bases nucléotidiques)
Fluorochromes
Ferritine
(cœur de fer opaque
aux électrons)
Or (ou argent)
colloïdal
Isotopes radioactifs
Enzymes (peroxydase ou phosphatase alcaline)
II – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
Marquage
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22. Faire une explication du
marquage avec HES en TP
d’histologie.
cours E. Grelier 22