La maîtrise des mammites s'appuie d'abord sur la différenciation de groupes de germes selon leurs réservoirs et modes de transmission. En pratique, le diagnostic de troupeau va s'appuyer sur un ensemble d'éléments cliniques, épidémiologiques, bactériologiques et analytiques. Ces différents indicateurs sont détaillés par Dominique Bergonier (ENVT, INRAe) dans le cadre du Webinaire de l'UMT Pilotage de la Santé des Ruminants dédié aux mammites.
2022-PRESENTATION DE PROJET FIN D'ETUDE-REHOUMA BASSEM.pptx
Le diagnostic de troupeau, étape-clef de la maîtrise des mammites
1. D. BERGONIER
ENV Toulouse
UMT IDELE – ENVT – INRAe « Pilotage de la santé des ruminants »
UMR INRAe – ENVT 1225 « Interactions hôtes – agents pathogènes »
Le DIAGNOSTIC de TROUPEAU,
étape-clef de la maîtrise des MAMMITES :
voies d’AMELIORATION,
apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
8.12.2021
2. • Repères méthodologiques
• Diagnostic descriptif (“documentaire”)
• Comptages cellulaires individuels
• Mammites cliniques
• Modélisation
• Diagnostic bactériologique
Plan
2
Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
3. Introduction : définitions
Définition opérationnelle des mammites :
inflammations mammaires “monobactériennes” dont la maîtrise pratique s’appuie en 1er lieu
sur la différenciation de groupes de germes selon leurs réservoirs et modes de transmission
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
èle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
“Modèles”
épidémiologiques
de transmission
“
”
Modes de transmission mixtes :
- soit réels : assez fréquent pour
des périodes longues
- soit proposés par
défaut…
Profils-types
extrêmes,
mais réels
4. Introduction : définition
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
èle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un él
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Entérobactéries
E. coli
Klebsiella sp.
Enterobacter
Serratia sp.,…
Streptocoques
S. uberis
E. faecium
E. faecalis,…
(SCN :
certaines
espèces ?)
S. aureus
Mycoplasmes
S. agalactiae
…
Staph. coag. –
Corynébactéries
Strep. dysgalactiae
Strep. uberis,…
• Autres bactéries :
transmission non spécifique par la traite
• Transmis
par la traite
Germes :
• “Contagieux”
4
Bactéries associées
5. Objectifs :
• caractériser les mammites
• +/- proposer un “modèle”
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 1 : (pré-)diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Diagnostic de troupeau : repères méthodologiques
- Modes de transmission : en fait
complexes et souvent peu spécifiques
- Diversité microbienne
- Nécessaire bonne connaissance
des bactéries (traitement, vaccins,…)
- Origine polyfactorielle
- Importance de la prévention,…
Contemporain et Rétrospectif Zootechnique et Bactériologique
Bilan diagnostique complet, systémique et explicatif
Analyse
des facteurs
de risque
Orientation clinique
et épidémiologique
Développer un diagnostic global de troupeau
reposant sur la complémentarité de 3 approches
Etape probabiliste, mais
exhaustive et rétroactive
2 étapes de confirmation
des hypothèses et
d’approfondissement
Explicative
a posteriori,
probabiliste
Informations certaines,
mais instantanées
et trop restreintes
(3 étapes) (l’élevage en entier) (base du plan d’action)
6. Diagnostic descriptif : indicateurs
Etape 1 : (pré-)diagnostic
descriptif
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 3 : diagnostic
analytique
Indicateur de prévalence collective (troupeau)
et d’évaluation de l’efficacité des mesures de maîtrise :
• Comptages cellulaires de tank (car paiement, mais limites significatives)
• Autres marqueurs possibles :
Indicateurs d’incidence et de prévalence individuelles
et de caractérisation épidémiologique…
• Comptages cellulaires individuels
• Autres marqueurs possibles (enzymes, cathélicidines,…)
• Critères complémentaires actuels :
- conductivité électrique (en ligne et par quartier)
- robots : évaluations cellulaires, autres marqueurs à venir… (non bactériens)
- comptages cellulaires différenciés
Indicateurs cliniques (et d’évaluation de l’efficacité des traitements)
• Mammites cliniques
Diagnostic
d’orientation
reposant sur 3 types d’indicateurs
(à ce jour)
- spécifiques (existant : agents contagieux quantifiés)
- non spécifiques (biomarqueurs mammaires, SMIR,…)
6
7. Diagnostic descriptif : voies d’amélioration possibles
Optimiser
nos pratiques
Améliorer les outils
récents et
leur utilisation
Evaluer les
nouveaux outils
Prévalence
collective :
Incidence et
prévalence
individuelles :
Mammites
cliniques :
Indicateur de :
• CCT : meilleure
valorisation
ciblée
• CCI : indicateurs
• CCI : logiciels,…
• Enzymes : LDH,…
• Comptages cellulaires
différenciés
• Robots :
autres marqueurs
- spectroscopie
proche IR
- bio-capteurs,…
• Tank :
identification des
vaches cellulaires
(génotypage)
• enregistrements :
exhaustifs et
complets
• indicateurs
7
… …
8. Indicateurs épidémiologiques de base
Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémiologique
Taux
d’atteinte :
• ensemble
des
infections (P)
• nouvelles
infections (I)
Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx
Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem)
Incidences mensuelles :
N et % CCI > 300 000 * (mois N) et < 300 000 (N-1)
Répartition : incidence mensuelle en fonction de
stade de L., rang de lactation,…
x
Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x
Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x
Période
sèche
Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x)
Indice de nouvelles infections :
% VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000)
xx x
Comptages cellulaires individuels : indicateurs
Importance :
gras ++
gras et souligné +++ * Seuil à affiner – Cf infra
Privilégier les indicateurs d’incidence différenciée (“répartition”,…), par période-clef
(indicateurs “dynamiques”)
(Cf tableau diapo 14)
9. Indicateurs épidémiologiques de base
Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémio
Bactério
ciblée
Taux
d’atteinte :
• ensemble
des
infections
• nouvelles
infections
Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx
Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem)
Incidences mensuelles :
N et % CCI > 300 000* (mois N) et < 300 000 (N-1)
Répartition : incidence mensuelle en fonction de
stade de L., rang de lactation,…
x
Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x
Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x
Période
sèche
Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x)
Indice de nouvelles infections :
% VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000)
xx x
Comptages cellulaires individuels : indicateurs
•
•
•
- Prévention ou Elimination ?
- Lactation ou Période Sèche ?
- situation des L1 ?
Questions – clefs :
9
10. • Caractérisation des mammites cliniques
• Indices d’infections en période sèche
Comptages cellulaires individuels : logiciels,…
10
• Caractérisation cellulaire
12. Objectifs
Mammites cliniques : marges de progrès
• Améliorer la détection
détection en ligne, conductivité, 1ers jets, filtres…
• Enregistrer toutes les mammites
quelque soit la sévérité, le traitement ou pas,…
• Caractériser les cas :
- identification : vache et quartier
- ordre : 1er cas, rechute ou récidive
- sévérité clinique
- traitements
- …
• Résultat bactériologique
Grade 1 :
lait modifié
(grumeaux,…)
Grade 2 :
signes
mammaires
en plus
(aigus : rougeur,
chaleur, douleur,
tuméfaction)
Grade 3 :
signes
généraux en
plus
Gradation clinique simple
Exemple de grille à 3 grades
13. Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémio
Bactério
ciblée
Taux
d’atteinte
“Incidence” clinique totale (ordre 1 et +)
globale (12 mois) : N de cas /100 VL présentes /an
xx
N de cas clinique / VL atteinte :
N cas / N VL avec au moins 1 cas
x
Répartition Incidence (ordre 1 et +) en fonction de :
stade de L., rang de L., mois
x
Gravité % de cas avec signes généraux (grade 3) x x
Fluctuations,
guérison
Taux de CCI > 300 000 avant le cas clinique x
Taux de CCI < 300 000 après cas clinique (30-60 jrs) x
Récurrences Taux de rechute clinique après traitement (%) xx x
Taux de récidive clinique (définir quartiers)
•
Prévention ou Elimination
•
•
•
Indicateurs épidémiologiques de base
Mammites cliniques : indicateurs
13
Importance :
gras ++
gras et souligné +++
(Cf tableau dia 14)
14. Etape 1 : diagnostic descriptif
14
Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites
Période Principaux critères Traite Environ-
nement
Lactation
Taux
d’atteinte
Prévalence globale :
% CCI > 300 000 cell/ml
> 25 < 15
Incidence clinique totale globale :
nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an
< 25 > 25
Mammites
cliniques
CCI avant phase clinique :
% cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml
> 65 < 30
Gravité clinique :
% cas avec signes généraux
< 5 > 15
Nombre de cas cliniques par vache atteinte :
nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas
> 1,5 < 1,2
Indice de guérison des cas cliniques :
% cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours
< 50 > 75
Période
sèche
Mammites
subcliniques
Indice de guérison :
% VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml
< 50 > 70
Indice de nouvelle infections :
% VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml
< 10 > 20
Référentiel
SNGTV,
2013
• Différenciation Traite – Environnement
• puis sous-modèles
Formulation d’hypothèse(s) opérationnelle(s)
15. 15
Période Critère Traite Environ-
nement
Lactation
Taux
d’atteinte
Prévalence globale :
% CCI > 300 000 cell/ml
> 25 < 15
Incidence clinique totale globale :
nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an
< 25 > 25
Mammites
cliniques
CCI avant phase clinique :
% cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml
> 65 < 30
Gravité clinique :
% cas avec signes généraux
< 5 > 15
Nombre de cas cliniques par vache atteinte :
nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas
> 1,5 < 1,2
Indice de guérison des cas cliniques :
% cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours
< 50 > 75
Période
sèche
Mammites
subcliniques
Indice de guérison :
% VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml
< 50 > 70
Indice de nouvelle infections :
% VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml
< 10 > 20
CONDITIONS pratiques d’optimisation du diagnostic d’orientation :
Pour gagner en précision et efficacité
(limiter les hypothèses indifférenciées par défaut, de type “modèle d’association”) :
• Restreindre à l’intervalle de temps associé à l’épisode à caractériser
(limiter le recouvrement)
• Exclure les principaux facteurs de confusion :
- anciennes mammites chroniques (incurables)
- confusion entre rechute et récidive
- vache à 3 quartiers
- utilisation améliorée des CCI avant-après période sèche (cf diapo 35)
- …
• Avoir des données complètes :
- mammites cliniques récentes (± guérison inconnue),…
- enregistrements complets des mammites cliniques
- …
Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites
16. • Repères méthodologiques
• Diagnostic descriptif
• Diagnostic bactériologique
Plan – Partie 1
Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU
17. Etape 1 : diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Contraintes, limites :
1. CONTAMINATION des prélèvements
2. Résultats faussement négatifs :
Sans optimisation culturale :
- mammites subcliniques : 25-35%
- mammites cliniques : 5-18%
3. Coût
4. (Relative lenteur de certaines analyses ?)
…
A développer !
Diagnostic bactériologique : contraintes
17
18. Etape 1 : diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Diagnostic bactériologique : solutions
Solutions actuelles :
(domaine évolutif)
1. PCR multiples :
Progrès technologique très intéressant, mais :
- multi-positivités fréquentes : faux-positifs ++
car sensibilité analytique +++,
détection des bactéries vivantes et mortes,
et contamination fréquente des prélèvements
- pas de témoin de contamination
- PCR “fermées” (liste préexistante de cibles)
À réserver
à certaines
utilisations
particulières
(et prélèvements
rigoureusement
aseptiques)
Contraintes, limites
18
PCR traditionnelle
PCR multiple
x 3-4
19. Diagnostic bactériologique : solutions
2. Culture conventionnelle (en laboratoire),
identification par spectrométrie de masse
(MALDI-TOF *)
Signature
protéique
des bactéries
* MALDI-TOF : Matrix-Assisted Laser Desorption/ionisation - Time Of Flight
• Fiabilité (discrimination)
• Rapidité
• Facilité
• Coût
+/- inchangé
• Futur :
antibio-
résistance,
pathotypage
possibles
(en partie)
(Très) bonnes performances :
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Solutions
20. Diagnostic bactériologique : solutions
3. Culture et diagnostic “présomptif” :
- méthode simple et rapide,
- modulable : identifications +/- poussées
• simplicité, rapidité
• coût réduit
• donc bonne adaptation au contexte actuel :
résultats bactériologiques nécessaires pour
l’antibiothérapie, la vaccination, la maîtrise,…
• association de milieux de culture :
- pertinente : complémentarité des milieux chromogènes
électifs, sélectifs (+ TSS)
- adaptée à l’objectif : types de bactéries recherchées,…
• conditions de culture
• connaître les limites (vérifications Maldi-Tof, contrôle qualité,…)
• …
Solutions
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Intéressante en particulier si optimisée :
Plusieurs avantages :
20
21. Diagnostic bactériologique : solutions
4. Culture et diagnose d’orientation :
identification présomptive de certains
groupes de germe
Solutions
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Staph
Coliformes
PetriFilm®
Géloses
compartimentées
Limites :
• Certains germes non mis en évidence
(PetriFilm® : streptocoques,…)
• Témoin de contamination ?
• simplicité et coût réduit :
PetriFilm® utilisé en élevages
(USA,…)
• rapidité
• sélectivité intéressante
de certains milieux
VétoRapid®
Atouts :
21
Milieu gélifié
et déshydraté
Autres : Entérobactéries, E. coli,…
22. Un diagnostic de troupeau approfondi…
… base de l’adaptation et de l’efficacité des plans d’action
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 1 : pré-diagnostic
documentaire
Etape 3 : diagnostic
analytique
Evaluation
du rapport
coût / bénéfice.
Suivi régulier.
Bilan diagnostique complet, systémique, explicatif
PRÉVENTION
des nouvelles infections
ELIMINATION
des infections existantes
Plan d’action
Etiologiquement adapté, Techniquement efficace, Economiquement rentable
- Traitement en lactation
- Traitement HL
- Réforme ciblée
- (tarissement anticipé,…)
- Correction des facteurs de risque
- Amélioration additionnelle des pratiques
- Obturation des trayons HL
- +/- Immuno-stimulation : vit.-OE, vaccin,…
- Biosécurité, Génétique,…
23. • Comptages cellulaires totaux (conventionnels) :
intérêts et limites pratiques
• Méthode
• Facteurs de variation non infectieux
• Facteurs de variation infectieux
• Utilisation
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
Plan – Partie 2
23
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
24. Méthode de référence (M. opto-fluoro-électronique) (ISO13366-2 – IDF148-2)
Comptages cellulaires totaux (conventionnels)
2. Dénombrement : intensité
de fluorescence
Messung
Quantification de
la fluorescence
émise
Cytométrie de flux
Cellules alignées
Stimulation
des ¢ par
lumière de
longueur
d’onde
spécifique
24
Laser
1. Coloration fluorescente de l’ADN
des noyaux (bromure d’éthidium) :
o leucocytes et ¢ épithéliales :
- Bv, Ov : < 5-7%
- Cp : % parfois supérieur
o ¢ viables et ¢ mortes
(ou apoptotiques)
2 caractéristiques communes
aux comptages différenciés
actuels (cytométrie de flux)
Performances : répétabilité fonction de la gamme
écarts-types tolérés de 10% (< 150 000) à < 3% (> 1,5.106 cell/ml)
25. Méthode OFE : déclinaisons actuelles
Ordre décroissant de fréquence d’utilisation :
Quantification de l’ADN nucléaire
- Laboratoires (LIALs) : compteurs
automatisés de haut débit
• de 1ères générations :
comptage (c.) indifférencié
• de dernière génération :
c. différencié (Foss® 7DC)
- Robots :
• OCC (DeLaval)
- Compteurs portatifs :
• DCC (DeLaval Cell Counter)
• [RT10 et application iPhone :
compteurs de poche – DeLaval]
DCC
Comptages cellulaires totaux
Foss® 7DC
RT10
(2015) 25
26. 1. Infections intra-mammaires
(actualité et histoire infectieuses)
Facteurs de variation des comptages cellulaires (base de leur utilisation)
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• …
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
carrière
année
journée
traite
½ journée
Temporalités :
Impact
Principes communs aux CCS totaux et CCD (différenciés) – Cas des CCS totaux (vache) :
décroissant
27. 1. Infections intra-mammaires
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• …
2.2. Facteurs zootechniques ou sanitaires :
• transitions : conduite et/ou alimentation
• autres modifications de l’environnement :
stress thermique, météo (autre), isolement, surtraite,
baisse de production, vaccin,…
• affections intercurrentes (BVD,…),…
• [monotraite]
2.3. Facteurs génétiques :
• Héritabilité : vache : 0,10 – 0,17
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
INTERACTIONS
• entre facteurs
non infectieux
• effets
physiologiques
plus marqués
chez les femelles
infectées
Facteurs de variation des comptages cellulaires (vache)
28. 1. Inf. intra-mammaires + CAEV, (Maedi), mycoplasmes
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation ++
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• Nombre d’agneaux allaités (+ traite)
• Mois de mise bas
• Œstrus,…
2.2. Facteurs zootechniques (ou sanitaires) ++
• transitions (conduite, alimentation) : mise à l’herbe
• autres modifications de l’environnement :
météo, baisse de production, vaccin, (surtraite),…
• affections intercurrentes (BD, parasitose,…),…
2.3. Facteurs génétiques :
• Héritabilité : Brebis : 0,11 – 0,15. Chèvre : 0,20 – 0,24
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
Facteurs de variation des comptages cellulaires : petits ruminants
Particularités
ovines
Particularités
caprines :
facteurs +
diversifiés
et souvent
d’effet + marqué
(et interactions)
29. 29
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Score CCS (¢/ml)
Facteurs physiologiques : stade et rang de lactation (vache)
Comptages cellulaires (CC) totaux : facteurs non infectieux
Début de lactation :
2 facteurs
- brève augmentation
physiologique (< 6 jrs)
- nouvelles infections
vraies, furtives :
SCN,… (L1 surtout).
Ovins, caprins : idem
Fin de lactation :
effet
“concentration”
Score log =
log2 (CCS/100 000) + 3
Ensemble des
CCI des vaches
P’Holstein,
France, 1997
Apport des CCDifférenciés ?
CDD ?
30. 30
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Score CCS
Stade de lactation : quantitativement
CC totaux : facteurs non infectieux
Fin de lactation :
effet “concentration”
P’Holstein,
France, 1997
L2 (par exemple), fin :
hausse de +1,7 log,
soit de 50 000 à 150 000
cell/ml en moyenne
L1, début :
– 1,3 log,
soit de 120 000 à
50 000 cell/ml
en moyenne
31. Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Rang de lactation : quantitativement
Effet Rang en fin de
lactation : +1,6 log, soit
de 95 000 à 270 000 cell/ml
en moyenne
Traitement HL sélectif :
adapter les seuils !
P’Holstein,
France, 1997
CC totaux : facteurs non infectieux
32. 32
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI Interaction globale
Stade x Rang de L. :
+ 2,7 log, soit de
50 000 à 270 000 cell/ml
en moyenne
Faire varier les
seuils en fonction
des rangs et stade
de L. des vaches
Rupp et al., 2000
Stade et rang de lactation : interaction
P’Holstein,
France, 1997
32
Score CCS
CC totaux : facteurs non infectieux
33. Figure 5. Median foremilk SCC for quarters sampled
between 0 and 4 days after calving, categorised by
pathogens present: No Growth, n = 5577 samples; Minor
pathogens (i.e. CNS or Corynebacterium spp.), n = 235;
Staph. aureus or other mixed major pathogens, n = 51;
and Strep. uberis, Strep. dysgalactiae or E. coli, n = 158.
Cows at very low yields will start to show signs of accelerated involution,
whereby the concentration of somatic cells being released into the milk
increases, in the absence of infection. This is shown clearly by the changes
in ICSCC for two members of an identical twinset (Figure 6), which
remained uninfected up until dry off. One member produced more than 5
Technote 16 discusse
of milk SCC before dry
Stade de lactation : période critique du post partum
New Zealand Technote 12 (2012)
N = 5577
N = 235
N = 51
N = 158
Médianes des CCS de quartiers prélevés entre J1 et J4 post partum
De 600 000 à
150 000 cell/ml
en 4 jours
(médiane)
Infections
à SCN de
début de
lactation :
- persistance
+ faible
- (CCS +
faibles
cf infra)
Echelle log
PM
pm
(pm): SCN,…
Effectifs :
CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
34. Conséquences : période sèche
Améliorer l’évaluation continue de la dynamique des infections :
o Adapter les seuils de CCS : fonction du rang de L.,…
o Intervalles entre prélèvements et tarissement ou MB :
- élevages à problèmes : pouvoir proposer des prélèvements mieux ciblés
pas dans 2-3 dernières semaines (fin de L.), ni les 8-10 premiers jrs post partum
- CCS +/- CCD
o Différencier Persistance vraie (= échec) versus Guérison puis Nouvelle Infection :
- conductivité par quartier (en ligne)
o Différencier les résultats en fonction des traitements : AB1 vs. AB2 vs. Obturateur
BILAN CELLULES
MAMMITES
Exemple
CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
35. • Comptages cellulaires totaux (conventionnels) :
intérêts et limites pratiques
• Méthode
• Facteurs de variation non infectieux
• Facteurs de variation infectieux
• Utilisation
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
Plan – Partie 2
35
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
37. Variations :
• En fonction de l’évolution de l’infection (Bv, Ov, Cp) :
o Guérison bactériologique et ¢re
o versus Chronicité clinique (fibrose, abcès)
o versus …
Van Werven et al., 1997
Seuil de
dépistage
(Infections intra-
mammaire)
CCS
Dopfer et al., 2000
CC totaux : facteurs infectieux
Exemple :
Strepto-
coques
Exemple :
E. coli
38. 38
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
1 cycle
Recrutement cellulaire (neutrophiles)
par vagues successives :
Gram+ > Gram –
Quartier : CCS (x 1000 cell/ml)
Jours
Quartier : UFColonies /ml
Durée moyenne des cycles : 3-7 jours
(en fonction de la vache, du germe)
• F. sinusoïdales : précoces, durables, régulières, d’amplitude forte et de période faible
• CCS et bactéries : F. concomitantes, mais asynchrones
o versus Chronicité subclinique : fluctuations (F)
CC totaux : facteurs infectieux
Exemple :
Staphylocoques
41. 41
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
Quartiers : CCS (x 1000 cell/ml)
Jours
Quartiers : UFC /ml
Comptages cellulaires différenciés ?
Seuil inférieur
utiliser le nombre de
dépassements de 2 seuils
Seuil supérieur
RÈGLE DE DÉCISION (classique et encore valide) :
Pour le suivi du statut infectieux des mamelles
(≠ dépistage) :
= gestion sanitaire a posteriori (plusieurs mois) :
Nombre de dépassements de :
- seuil inférieur = 250 000 cell/ml
- seuil supérieur = 800 000 cell/ml
par exemple ; en fonction des objectifs :
sensibilité ou spécificité privilégiée.
CCS :
o toujours < 250 000 : présumée “saine”
o au moins 2 > 800 000 : “infectée”
= “infectée durable” ou “récidivante”
o autres cas : “douteuse”
dont “infectée brève”
CC totaux : facteurs infectieux
42. MQC-C (Milk Quality Control – Cell count) :
Mesure de la viscosité du mélange lait + réactif (principe du CMT, automatisé)
Intervalles entre
pics (jours)
6 7 6 6 6 7 6 // 6 7 8 6 6
de 6 à 7 jours (3 mois)
Exemple visuel en robot de traite
Evaluations cellulaires de périodicité
ajustable : toutes les traites,
tous les jours, …
CC totaux : facteurs infectieux
43. +
Fortes fluctuations cellulaires sur des
intervalles très courts à long (lactation)
utiliser plusieurs valeurs successives
Distribution bimodale
seuils à adapter en fonction de l’objectif
Négatives Positives
Statut bactériologique
des mamelles
Distribution
des mamelles
Seuil
inférieur
Seuil
supérieur
Les problèmes et les solutions de principe (Bv, Ov, Cp)
Comptages cellulaires totaux : utilisation
3 classes et 2
N
44. +
Négatives Positives
Statut bactériologique
des mamelles
Distribution
des mamelles
Seuil
inférieur
Seuil
supérieur
Faux –
• fluctuations
• pathogènes mineurs
+/- effets combinés
N
Comptages cellulaires totaux : utilisation
Nature des faux-positifs et faux-négatifs : synthèse
Faux +
Effets, parfois combinés, de:
• début de lactation, L1
• stress thermique,…
• fin de lactation, vieille VL
(+ traite du soir)
45. • Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
45
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
46. Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Macrophages Phagocytose par Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
Sécrétion
accrue d’Ac
opsonisants
Activation du
complément
par Ac
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
4 types principaux de cellules : fonctions
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % si
quartiers sains
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Adapté selon Zaatout et al., 2020 46
47. Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Phagocytose par Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- en poste ou en
patrouille
Fort % si
quartiers sains
Macrophages
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % si
quartiers sains
47
48. Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
Macrophages
• Polymorpho-
nucléaires
Neutrophiles :
- Phagocytes
professionnels
majeurs
Très fort % +++
si infection
Leucocytes
“migrants”
(récents)
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- en poste ou en
patrouille
Fort % si
quartiers sains
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % ++
si quartiers sains
48
49. Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Macrophages
• Cellules
épithéliales :
- sentinelles IIres
- ingestion de
bactéries,…
¢ mammaires,
constitutives,
non
inflammatoires
(lactifères ou
sécrétrices)
Très faible %
• Neutrophiles :
- Phagocytes
professionnels
majeurs
Très fort % +++
si infection
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Leucocytes
“résidents”
Leucocytes
“migrants”
(récents)
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- L¢ en poste ou
en patrouille
Fort % si
quartiers sains
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % ++
si quartiers sains
50. • Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Cytométrie de flux
• Microscopie
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
50
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
51. Plusieurs paramètres
analysables pour
chaque ¢
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
Cytométrie de flux
= technique d’identification, voire de caractérisation, des cellules (avec quantification)
• Marquage cellulaire : > indifférencié : colorants de l’ADN (CCS ou CCD)
> différencié :
Anticorps
monoclonaux
couplés à
un fluorochrome
Des populations
Un état de diffé
Technologie qui permet d’identifier e
manière quantitative et qualitative des po
Présence de
surface des cel
(CD, cluster de
Ces marqueurs permettent de distinguer:
La cytométrie en flu
Marquage spécifique
d’antigènes leucocytaires
de surface
Différenciation cellulaire fiable et utile
Non disponible en automate haut débit à ce jour (?)
(selon informations disponibles)
52. • Diffraction dans l’axe : taille des ¢
• Diffraction latérale : granularité des ¢
Laser
Cellule
Filtres, miroirs
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Caractérisation
cellulaire
o Marquage
spécifique (1 à 4)
o Caractères
physiques
des ¢
Granularité => différenciation (présomptive)
Taille
Détecteurs
53. Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Compteur disponible en LIAL pour CCD : Fossomatic® 7 DC
DE
MACROPHAGES
N°
20
s
Débris
(bruit de fond)
Base technique de la
différenciation cellulaire utilisée
(brevet)
Flux
cellulaire
Granularité
Canal de fluorescence 2
Canal de fluorescence 1
Coloration (ADN) : acridine orange
Sous-populations
cellulaires
différenciées Neutrophiles +
Lymphocytes
Macrophages
¢ somatiques
54. • Comptages (absolus et relatifs %) :
o leucocytaire total (sans ¢ épithéliales)
o 3 types majeurs différenciés :
- lymphocytes
- macrophages
- neutrophiles
• Intérêt d’utiliser des ratios, quelle que soit la méthode :
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
Decoding the immune system for earlier
more accurate detection
Modeled after the blood leukocyte differential, a test
routinely used in humans and companion animals
to detect infection, QScout®
MLD identifies and
differentiates leukocytes (white blood cells) in milk. Each
of the three white blood cell types (described below and
shown in Figure 1) play a key role in fighting infection, a
each has a different function in the immune system.
Scout inf ec
Figure 1. Fluorescent imaging differentiates cell types
Zoetis
Microscopie à fluorescence :
CCD
par
quartier
Microscopie à fluorescence et reconnaissance d’images
o Opposer 2 groupes de variations inverses :
¢ résidentes, pré-inflammatoires : Macrophages, Lymphocytes
¢ inflammatoires survenant massivement lors de mammite : Neutrophiles
o Ratio Neutrophiles / Lympho¢ (bien corrélé à bactériologie), ou Neutrophiles / Macrophages
- de laboratoire
- portative
(Gonçalves et al., 2017)
55. • Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
• Facteurs non infectieux de variation
• Facteurs infectieux de variation
• Performances diagnostiques connues
Conclusion
55
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
56. CCD : Facteurs non infectieux de variation
Stade et rang de lactation principalement
Etude Italie 2020 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses
• Durée : 23 mois (CL)
Zecconi et al., 2020
% L¢ + Neutrophiles en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS
Stade de L. :
élévations (p<0,001)
- en début de L.
- fin : VL âgées
Ex des L3 :
∆ 10% entre
début et fin
< 50 000 cell/ml :
L¢ ++, PMNN -
?
57. CCD : Facteurs non infectieux de variation
Etude Italie 2020 (CL) :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses
• Durée : 23 mois
% L¢ + Neutrophiles pour des CCS en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS
Interactions stade x rang de L. et stade x CCS
Rang de L. :
(p<0,001)
- à CCS égaux et
faibles, et stade
de L. fixé, % +
élevés chez
L1 surtout,
puis L ≥ 4
- L1 : CCS les +
faibles et CCD
les + élevés
Stade et rang de lactation principalement
Cellularité particulière
des L1
58. CCD : Facteurs infectieux de variation
Sous-populations cellulaires
en fonction des CCS
Damm et al., 2017
• Autres :
pentes + fortes
- Macrophages : décroissance
- Neutrophiles : augmentation
Microscopie à fluorescence
(comme référence par rapport au 7 DC)
1ère étude sur Foss® 7 DC :
• Technique : microscopie
• N=293 laits
• Etude non indépendante
• A confirmer (dans diverses situations
physiologiques, bactériologiques,…)
• Lymphocytes (%) :
avec l’augmentation des CCS,
décroissance :
- de pente faible
- entre 20 et 1%
59. CCD : Facteurs infectieux de variation
Sous-populations cellulaires
en fonction des types de
bactéries pathogènes
Kirkeby et al., 2019
• La dispersion des % dans
l’intervalle log 4-6 paraît assez
proche entre :
- “No pathogens” : 32-81%
- “PMajeur” : 33-88%
- “pmineur” : 33-84%
• A préciser
Etude Danemark 2019 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 2 élevages, 3800 analyses
• Durée : 1 an (CL)
• Etude non indépendante
60. Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur
prédictive
positive
Valeur
prédictive
négative
CCD : Performances diagnostiques ?
Performances des CCS et de l’association CCS + CCD
Etude Québec 2020 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs * : 11 élevages,
4 CL successifs (1107 CL)
bactériologie : composite
• Bactériologie (1 seule) :
- négatif : 17%
- PM ** : 13%
- pm : 62%
• Etude non indépendante
• CCS seuls
(Schwarz et al., 2020)
Pas d’étude indépendante (avec même technique).
Peu d’études comparatives de qualité.
Choix de l’étude québécoise récente comme exemple car :
- assez large * ; conditions du terrain (données de CL)
- mais ne présentant que les résultats relatifs aux PM ** (fréquent)
Bon compromis
(si seuil par défaut)
Mauvaise sensibilité
Mauvaise
à médiocre
Très
bonne
Invariables Dépendant de la prévalence
61. CCD : Performances diagnostiques ?
Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur
prédictive
positive
Valeur
prédictive
négative
encore +
mauvaise
à médiocre
très
Très bonne
Sensibilité
améliorée
Spécificité
détériorée
*
26 à 36% des mamelles
bactério – présentent
un % Neutrophiles
+ L¢ élevé
*
Performances en englobant les pathogènes mineurs ?
• Association CCS + CCD
61
62. Bilan, conclusion
62
• Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion
o Performances bien connues
Paramètre historique, « indétrônable » (paiement du lait)…,
mais assez peu adapté à 1 discrimination précise des mamelles
selon leur statut infectieux, car au moins 3 limites significatives :
Donc à utiliser en connaissant ses limites :
- ≠ outil de Diagnostic (certitude)
- mais = Dépistage de masse (de 1ère intention)
Faux-positifs Facteurs de variation non infectieux
Faux-négatifs “Pulsatilité” des CCS – pathogènes mineurs
63. Bilan, conclusion
63
o Périodes-clefs : antibiothérapie HL ciblée (nouveau Règlement UE 2022)
S’appuyer sur la VPN, en valorisant plusieurs CCS : 85% à 96% (fonction des études)
obturateurs de trayons
Reste du troupeau = quelques rares “douteuses” + infectées
ABthérapie HL à visée curative, avec spécialités à persistance moyenne
Plus généralement (HL et en lactation) :
associer plusieurs analyses, décalées dans le temps (fluctuations),
et si possible de nature différente :
évaluations cellulaires fréquentes (robots)
conductivité par quartier (en ligne) à interpréter en relatif
bactériologie (simplifiée, mais optimisée)
CCD,…
• Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion
64. • Comptages cellulaires différenciés : Bilan d’étape
o Principe très intéressant dans le “paysage diagnostique” actuel,
encore assez pauvre, mais en évolution
o Déclinaison commerciale disponible :
Intérêt +++ : haut débit
Physiologiquement :
par rapport aux CCS, 2 à 3 difficultés persistent : F. de V. non infectieux, “pulsatilité” (pm ?)
Techniquement :
différenciation cellulaire partielle (2 groupes)
Etudes complémentaires nécessaires (labo + élevages) :
- F. de variation à préciser : liés aux VL, bactéries et élevages (seuils à adapter)
- études longitudinales
o Utilisation 1 : dépistage optimisé par l’amélioration de la sensibilité (70% à 88%)
Faux + donc bactériologie simple de confirmation (cas les + douteux)
o Utilisation 2 : évaluation de l’efficacité des traitements (Ecoantibio) : + précise, + rapide ?
o Utilisation 3 (moyen terme) : phénotype possible pour sélection génétique
Bilan, conclusion