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1 von 64
D. BERGONIER
ENV Toulouse
UMT IDELE – ENVT – INRAe « Pilotage de la santé des ruminants »
UMR INRAe – ENVT 1225 « Interactions hôtes – agents pathogènes »
Le DIAGNOSTIC de TROUPEAU,
étape-clef de la maîtrise des MAMMITES :
voies d’AMELIORATION,
apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
8.12.2021
• Repères méthodologiques
• Diagnostic descriptif (“documentaire”)
• Comptages cellulaires individuels
• Mammites cliniques
• Modélisation
• Diagnostic bactériologique
Plan
2
Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Introduction : définitions
Définition opérationnelle des mammites :
inflammations mammaires “monobactériennes” dont la maîtrise pratique s’appuie en 1er lieu
sur la différenciation de groupes de germes selon leurs réservoirs et modes de transmission
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
èle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Modèle
d'association
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
“Modèles”
épidémiologiques
de transmission
“
”
Modes de transmission mixtes :
- soit réels : assez fréquent pour
des périodes longues
- soit proposés par
défaut…
Profils-types
extrêmes,
mais réels
Introduction : définition
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
èle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'environnement
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Figure 26 : Evolution des mammites dans un él
(61)
IV. Diagnostic
Modèle
d'association
Modèle
d'exposition
Modèle de traite Situation saine
Entérobactéries
E. coli
Klebsiella sp.
Enterobacter
Serratia sp.,…
Streptocoques
S. uberis
E. faecium
E. faecalis,…
(SCN :
certaines
espèces ?)
S. aureus
Mycoplasmes
S. agalactiae
…
Staph. coag. –
Corynébactéries
Strep. dysgalactiae
Strep. uberis,…
• Autres bactéries :
transmission non spécifique par la traite
• Transmis
par la traite
Germes :
• “Contagieux”
4
Bactéries associées
Objectifs :
• caractériser les mammites
• +/- proposer un “modèle”
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 1 : (pré-)diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Diagnostic de troupeau : repères méthodologiques
- Modes de transmission : en fait
complexes et souvent peu spécifiques
- Diversité microbienne
- Nécessaire bonne connaissance
des bactéries (traitement, vaccins,…)
- Origine polyfactorielle
- Importance de la prévention,…

Contemporain et Rétrospectif Zootechnique et Bactériologique
Bilan diagnostique complet, systémique et explicatif
Analyse
des facteurs
de risque
Orientation clinique
et épidémiologique
Développer un diagnostic global de troupeau
reposant sur la complémentarité de 3 approches
Etape probabiliste, mais
exhaustive et rétroactive
2 étapes de confirmation
des hypothèses et
d’approfondissement
Explicative
a posteriori,
probabiliste
Informations certaines,
mais instantanées
et trop restreintes
(3 étapes) (l’élevage en entier) (base du plan d’action)
Diagnostic descriptif : indicateurs
Etape 1 : (pré-)diagnostic
descriptif
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 3 : diagnostic
analytique
 Indicateur de prévalence collective (troupeau)
et d’évaluation de l’efficacité des mesures de maîtrise :
• Comptages cellulaires de tank (car paiement, mais limites significatives)
• Autres marqueurs possibles :
 Indicateurs d’incidence et de prévalence individuelles
et de caractérisation épidémiologique…
• Comptages cellulaires individuels
• Autres marqueurs possibles (enzymes, cathélicidines,…)
• Critères complémentaires actuels :
- conductivité électrique (en ligne et par quartier)
- robots : évaluations cellulaires, autres marqueurs à venir… (non bactériens)
- comptages cellulaires différenciés
 Indicateurs cliniques (et d’évaluation de l’efficacité des traitements)
• Mammites cliniques
Diagnostic
d’orientation
reposant sur 3 types d’indicateurs
(à ce jour)
- spécifiques (existant : agents contagieux quantifiés)
- non spécifiques (biomarqueurs mammaires, SMIR,…)
6
Diagnostic descriptif : voies d’amélioration possibles
Optimiser
nos pratiques
Améliorer les outils
récents et
leur utilisation
Evaluer les
nouveaux outils
Prévalence
collective :
Incidence et
prévalence
individuelles :
Mammites
cliniques :
Indicateur de :
• CCT : meilleure
valorisation
ciblée
• CCI : indicateurs
• CCI : logiciels,…
• Enzymes : LDH,…
• Comptages cellulaires
différenciés
• Robots :
autres marqueurs
- spectroscopie
proche IR
- bio-capteurs,…
• Tank :
identification des
vaches cellulaires
(génotypage)
• enregistrements :
exhaustifs et
complets
• indicateurs
7
… …
Indicateurs épidémiologiques de base
Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémiologique
Taux
d’atteinte :
• ensemble
des
infections (P)
• nouvelles
infections (I)
Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx
Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem)
Incidences mensuelles :
N et % CCI > 300 000 * (mois N) et < 300 000 (N-1)
Répartition : incidence mensuelle en fonction de
stade de L., rang de lactation,…
x
Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x
Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x
Période
sèche
Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x)
Indice de nouvelles infections :
% VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000)
xx x
Comptages cellulaires individuels : indicateurs
Importance :
gras ++
gras et souligné +++ * Seuil à affiner – Cf infra
Privilégier les indicateurs d’incidence différenciée (“répartition”,…), par période-clef
(indicateurs “dynamiques”)
(Cf tableau diapo 14)
Indicateurs épidémiologiques de base
Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémio
Bactério
ciblée
Taux
d’atteinte :
• ensemble
des
infections
• nouvelles
infections
Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx
Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem)
Incidences mensuelles :
N et % CCI > 300 000* (mois N) et < 300 000 (N-1)
Répartition : incidence mensuelle en fonction de
stade de L., rang de lactation,…
x
Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x
Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x
Période
sèche
Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x)
Indice de nouvelles infections :
% VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000)
xx x
Comptages cellulaires individuels : indicateurs
•
•
•
- Prévention ou Elimination ?
- Lactation ou Période Sèche ?
- situation des L1 ?
Questions – clefs :
9
• Caractérisation des mammites cliniques
• Indices d’infections en période sèche
Comptages cellulaires individuels : logiciels,…
10
• Caractérisation cellulaire
……
11
CCI : logiciels, plates-formes digitales
Objectifs
Mammites cliniques : marges de progrès
• Améliorer la détection
détection en ligne, conductivité, 1ers jets, filtres…
• Enregistrer toutes les mammites
quelque soit la sévérité, le traitement ou pas,…
• Caractériser les cas :
- identification : vache et quartier
- ordre : 1er cas, rechute ou récidive
- sévérité clinique
- traitements
- …
• Résultat bactériologique
Grade 1 :
lait modifié
(grumeaux,…)
Grade 2 :
signes
mammaires
en plus
(aigus : rougeur,
chaleur, douleur,
tuméfaction)
Grade 3 :
signes
généraux en
plus
Gradation clinique simple
Exemple de grille à 3 grades
Domaine Indicateur Marge
de
progrès
Modèle
épidémio
Bactério
ciblée
Taux
d’atteinte
“Incidence” clinique totale (ordre 1 et +)
globale (12 mois) : N de cas /100 VL présentes /an
xx
N de cas clinique / VL atteinte :
N cas / N VL avec au moins 1 cas
x
Répartition Incidence (ordre 1 et +) en fonction de :
stade de L., rang de L., mois
x
Gravité % de cas avec signes généraux (grade 3) x x
Fluctuations,
guérison
Taux de CCI > 300 000 avant le cas clinique x
Taux de CCI < 300 000 après cas clinique (30-60 jrs) x
Récurrences Taux de rechute clinique après traitement (%) xx x
Taux de récidive clinique (définir quartiers)
•
Prévention ou Elimination
•
•
•
Indicateurs épidémiologiques de base
Mammites cliniques : indicateurs
13
Importance :
gras ++
gras et souligné +++
(Cf tableau dia 14)
Etape 1 : diagnostic descriptif
14
Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites
Période Principaux critères Traite Environ-
nement
Lactation
Taux
d’atteinte
Prévalence globale :
% CCI > 300 000 cell/ml
> 25 < 15
Incidence clinique totale globale :
nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an
< 25 > 25
Mammites
cliniques
CCI avant phase clinique :
% cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml
> 65 < 30
Gravité clinique :
% cas avec signes généraux
< 5 > 15
Nombre de cas cliniques par vache atteinte :
nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas
> 1,5 < 1,2
Indice de guérison des cas cliniques :
% cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours
< 50 > 75
Période
sèche
Mammites
subcliniques
Indice de guérison :
% VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml
< 50 > 70
Indice de nouvelle infections :
% VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml
< 10 > 20
Référentiel
SNGTV,
2013
• Différenciation Traite – Environnement
• puis sous-modèles
Formulation d’hypothèse(s) opérationnelle(s)
15
Période Critère Traite Environ-
nement
Lactation
Taux
d’atteinte
Prévalence globale :
% CCI > 300 000 cell/ml
> 25 < 15
Incidence clinique totale globale :
nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an
< 25 > 25
Mammites
cliniques
CCI avant phase clinique :
% cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml
> 65 < 30
Gravité clinique :
% cas avec signes généraux
< 5 > 15
Nombre de cas cliniques par vache atteinte :
nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas
> 1,5 < 1,2
Indice de guérison des cas cliniques :
% cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours
< 50 > 75
Période
sèche
Mammites
subcliniques
Indice de guérison :
% VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml
< 50 > 70
Indice de nouvelle infections :
% VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml
< 10 > 20
CONDITIONS pratiques d’optimisation du diagnostic d’orientation :
Pour gagner en précision et efficacité
(limiter les hypothèses indifférenciées par défaut, de type “modèle d’association”) :
• Restreindre à l’intervalle de temps associé à l’épisode à caractériser
(limiter le recouvrement)
• Exclure les principaux facteurs de confusion :
- anciennes mammites chroniques (incurables)
- confusion entre rechute et récidive
- vache à 3 quartiers
- utilisation améliorée des CCI avant-après période sèche (cf diapo 35)
- …
• Avoir des données complètes :
- mammites cliniques récentes (± guérison inconnue),…
- enregistrements complets des mammites cliniques
- …
Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites
• Repères méthodologiques
• Diagnostic descriptif
• Diagnostic bactériologique
Plan – Partie 1
Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU
Etape 1 : diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Contraintes, limites :
1. CONTAMINATION des prélèvements
2. Résultats faussement négatifs :
Sans optimisation culturale :
- mammites subcliniques : 25-35%
- mammites cliniques : 5-18%
3. Coût
4. (Relative lenteur de certaines analyses ?)
…
A développer !
Diagnostic bactériologique : contraintes
17
Etape 1 : diagnostic
descriptif
Etape 3 : diagnostic
analytique
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Diagnostic bactériologique : solutions
Solutions actuelles :
(domaine évolutif)
1. PCR multiples :
Progrès technologique très intéressant, mais :
- multi-positivités fréquentes : faux-positifs ++
car sensibilité analytique +++,
détection des bactéries vivantes et mortes,
et contamination fréquente des prélèvements
- pas de témoin de contamination
- PCR “fermées” (liste préexistante de cibles)
À réserver
à certaines
utilisations
particulières
(et prélèvements
rigoureusement
aseptiques)
Contraintes, limites

18
PCR traditionnelle
PCR multiple
x 3-4
Diagnostic bactériologique : solutions
2. Culture conventionnelle (en laboratoire),
identification par spectrométrie de masse
(MALDI-TOF *)
Signature
protéique
des bactéries
* MALDI-TOF : Matrix-Assisted Laser Desorption/ionisation - Time Of Flight
• Fiabilité (discrimination)
• Rapidité
• Facilité
• Coût
+/- inchangé
• Futur :
antibio-
résistance,
pathotypage
possibles
(en partie)
(Très) bonnes performances :
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Solutions
Diagnostic bactériologique : solutions
3. Culture et diagnostic “présomptif” :
- méthode simple et rapide,
- modulable : identifications +/- poussées
• simplicité, rapidité
• coût réduit
• donc bonne adaptation au contexte actuel :
résultats bactériologiques nécessaires pour
l’antibiothérapie, la vaccination, la maîtrise,…
• association de milieux de culture :
- pertinente : complémentarité des milieux chromogènes
électifs, sélectifs (+ TSS)
- adaptée à l’objectif : types de bactéries recherchées,…
• conditions de culture
• connaître les limites (vérifications Maldi-Tof, contrôle qualité,…)
• …
Solutions
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Intéressante en particulier si optimisée :
Plusieurs avantages :
20
Diagnostic bactériologique : solutions
4. Culture et diagnose d’orientation :
identification présomptive de certains
groupes de germe
Solutions
Etape 2 : diagnostic bactériologique
Staph
Coliformes
PetriFilm®
Géloses
compartimentées
Limites :
• Certains germes non mis en évidence
(PetriFilm® : streptocoques,…)
• Témoin de contamination ?
• simplicité et coût réduit :
PetriFilm® utilisé en élevages
(USA,…)
• rapidité
• sélectivité intéressante
de certains milieux
VétoRapid®
Atouts :
21
Milieu gélifié
et déshydraté
Autres : Entérobactéries, E. coli,…
Un diagnostic de troupeau approfondi…
… base de l’adaptation et de l’efficacité des plans d’action
Etape 2 : diagnostic
bactériologique
Etape 1 : pré-diagnostic
documentaire
Etape 3 : diagnostic
analytique
Evaluation
du rapport
coût / bénéfice.
Suivi régulier.
Bilan diagnostique complet, systémique, explicatif
PRÉVENTION
des nouvelles infections
ELIMINATION
des infections existantes
Plan d’action
Etiologiquement adapté, Techniquement efficace, Economiquement rentable
- Traitement en lactation
- Traitement HL
- Réforme ciblée
- (tarissement anticipé,…)
- Correction des facteurs de risque
- Amélioration additionnelle des pratiques
- Obturation des trayons HL
- +/- Immuno-stimulation : vit.-OE, vaccin,…
- Biosécurité, Génétique,…
• Comptages cellulaires totaux (conventionnels) :
intérêts et limites pratiques
• Méthode
• Facteurs de variation non infectieux
• Facteurs de variation infectieux
• Utilisation
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
Plan – Partie 2
23
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Méthode de référence (M. opto-fluoro-électronique) (ISO13366-2 – IDF148-2)
Comptages cellulaires totaux (conventionnels)
2. Dénombrement : intensité
de fluorescence
Messung
Quantification de
la fluorescence
émise
Cytométrie de flux
Cellules alignées
Stimulation
des ¢ par
lumière de
longueur
d’onde
spécifique
24
Laser
1. Coloration fluorescente de l’ADN
des noyaux (bromure d’éthidium) :
o leucocytes et ¢ épithéliales :
- Bv, Ov : < 5-7%
- Cp : % parfois supérieur
o ¢ viables et ¢ mortes
(ou apoptotiques)
 2 caractéristiques communes
aux comptages différenciés
actuels (cytométrie de flux)
 Performances : répétabilité fonction de la gamme
écarts-types tolérés de 10% (< 150 000) à < 3% (> 1,5.106 cell/ml)
Méthode OFE : déclinaisons actuelles
Ordre décroissant de fréquence d’utilisation :
Quantification de l’ADN nucléaire
- Laboratoires (LIALs) : compteurs
automatisés de haut débit
• de 1ères générations :
comptage (c.) indifférencié
• de dernière génération :
c. différencié (Foss® 7DC)
- Robots :
• OCC (DeLaval)
- Compteurs portatifs :
• DCC (DeLaval Cell Counter)
• [RT10 et application iPhone :
compteurs de poche – DeLaval]
DCC
Comptages cellulaires totaux
Foss® 7DC
RT10
(2015) 25
1. Infections intra-mammaires
(actualité et histoire infectieuses)
Facteurs de variation des comptages cellulaires (base de leur utilisation)
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• …
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
carrière
année
journée
traite
½ journée
Temporalités :
Impact
Principes communs aux CCS totaux et CCD (différenciés) – Cas des CCS totaux (vache) :
décroissant
1. Infections intra-mammaires
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• …
2.2. Facteurs zootechniques ou sanitaires :
• transitions : conduite et/ou alimentation
• autres modifications de l’environnement :
stress thermique, météo (autre), isolement, surtraite,
baisse de production, vaccin,…
• affections intercurrentes (BVD,…),…
• [monotraite]
2.3. Facteurs génétiques :
• Héritabilité : vache : 0,10 – 0,17
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
INTERACTIONS
• entre facteurs
non infectieux
• effets
physiologiques
plus marqués
chez les femelles
infectées
Facteurs de variation des comptages cellulaires (vache)
1. Inf. intra-mammaires + CAEV, (Maedi), mycoplasmes
Comptages cellulaires totaux
2.1. Facteurs physiologiques :
• Rang de lactation
• Stade de lactation ++
• Variations journalières
• Intervalle entre traites (soir > matin)
• Fractions du lait (alvéolaire > autres)
• Nombre d’agneaux allaités (+ traite)
• Mois de mise bas
• Œstrus,…
2.2. Facteurs zootechniques (ou sanitaires) ++
• transitions (conduite, alimentation) : mise à l’herbe
• autres modifications de l’environnement :
météo, baisse de production, vaccin, (surtraite),…
• affections intercurrentes (BD, parasitose,…),…
2.3. Facteurs génétiques :
• Héritabilité : Brebis : 0,11 – 0,15. Chèvre : 0,20 – 0,24
1. Facteurs
de variation
infectieux
2. Facteurs
de variation
non
infectieux
Facteurs de variation des comptages cellulaires : petits ruminants
Particularités
ovines
Particularités
caprines :
facteurs +
diversifiés
et souvent
d’effet + marqué
(et interactions)
29
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Score CCS (¢/ml)
Facteurs physiologiques : stade et rang de lactation (vache)
Comptages cellulaires (CC) totaux : facteurs non infectieux
Début de lactation :
2 facteurs
- brève augmentation
physiologique (< 6 jrs)
- nouvelles infections
vraies, furtives :
SCN,… (L1 surtout).
Ovins, caprins : idem
Fin de lactation :
effet
“concentration”
Score log =
log2 (CCS/100 000) + 3
Ensemble des
CCI des vaches
P’Holstein,
France, 1997
Apport des CCDifférenciés ?
CDD ?
30
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Score CCS
Stade de lactation : quantitativement
CC totaux : facteurs non infectieux
Fin de lactation :
effet “concentration”
P’Holstein,
France, 1997
L2 (par exemple), fin :
hausse de +1,7 log,
soit de 50 000 à 150 000
cell/ml en moyenne
L1, début :
– 1,3 log,
soit de 120 000 à
50 000 cell/ml
en moyenne
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI
Rupp et al., 2000
Rang de lactation : quantitativement
Effet Rang en fin de
lactation : +1,6 log, soit
de 95 000 à 270 000 cell/ml
en moyenne
 Traitement HL sélectif :
adapter les seuils !
P’Holstein,
France, 1997
CC totaux : facteurs non infectieux
32
Stade de lactation (jours)
Score moyens mensuel de CCI Interaction globale
Stade x Rang de L. :
+ 2,7 log, soit de
50 000 à 270 000 cell/ml
en moyenne
 Faire varier les
seuils en fonction
des rangs et stade
de L. des vaches
Rupp et al., 2000
Stade et rang de lactation : interaction
P’Holstein,
France, 1997
32
Score CCS
CC totaux : facteurs non infectieux
Figure 5. Median foremilk SCC for quarters sampled
between 0 and 4 days after calving, categorised by
pathogens present: No Growth, n = 5577 samples; Minor
pathogens (i.e. CNS or Corynebacterium spp.), n = 235;
Staph. aureus or other mixed major pathogens, n = 51;
and Strep. uberis, Strep. dysgalactiae or E. coli, n = 158.
Cows at very low yields will start to show signs of accelerated involution,
whereby the concentration of somatic cells being released into the milk
increases, in the absence of infection. This is shown clearly by the changes
in ICSCC for two members of an identical twinset (Figure 6), which
remained uninfected up until dry off. One member produced more than 5
Technote 16 discusse
of milk SCC before dry
Stade de lactation : période critique du post partum
New Zealand Technote 12 (2012)
N = 5577
N = 235
N = 51
N = 158
Médianes des CCS de quartiers prélevés entre J1 et J4 post partum
De 600 000 à
150 000 cell/ml
en 4 jours
(médiane)
Infections
à SCN de
début de
lactation :
- persistance
+ faible
- (CCS +
faibles
cf infra)
Echelle log
PM
pm
(pm): SCN,…
Effectifs :
CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
Conséquences : période sèche
Améliorer l’évaluation continue de la dynamique des infections :
o Adapter les seuils de CCS : fonction du rang de L.,…
o Intervalles entre prélèvements et tarissement ou MB :
- élevages à problèmes : pouvoir proposer des prélèvements mieux ciblés
pas dans 2-3 dernières semaines (fin de L.), ni les 8-10 premiers jrs post partum
- CCS +/- CCD
o Différencier Persistance vraie (= échec) versus Guérison puis Nouvelle Infection :
- conductivité par quartier (en ligne)
o Différencier les résultats en fonction des traitements : AB1 vs. AB2 vs. Obturateur
BILAN CELLULES
MAMMITES
Exemple
CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
• Comptages cellulaires totaux (conventionnels) :
intérêts et limites pratiques
• Méthode
• Facteurs de variation non infectieux
• Facteurs de variation infectieux
• Utilisation
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
Plan – Partie 2
35
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
C
o
l
i
f
o
r
m
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S
t
r
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p
.
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g
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l
a
c
t
i
a
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S
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r
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p
.
d
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C
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b
o
v
i
s
S
t
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p
h
y
l
o
c
o
q
u
e
s
c
o
a
g
.
m
o
i
n
s
Moyennes arithmétiques Moyennes géométriques
0
5
10
15
20
C
o
l
i
f
o
r
m
e
s
S
t
r
e
p
.
a
g
a
l
a
c
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p
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p
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d
y
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S
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S
t
a
p
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l
o
c
o
q
u
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c
o
a
g
.
m
o
i
n
s
C
o
r
y
n
e
b
a
c
t
e
r
i
u
m
b
o
v
i
s
Facteur multiplicatif
Variations :
• En fonction des bactéries
(Bv, Ov, Cp)
Intensité du recrutement
cellulaire moyen (vache)
(Djabri et al., 2000 – Méta-analyse: 20 publications)
17
13
9
5,7 5
1,5
2
CCS (x1000) cell/ml
 Faibles ≠ entre pathogènes
mineurs (pm : SCN,
corynébactéries,…)
et négatifs ou
fin de lactation :
confusion possible
 CCD ?
36
(quartiers)
475 000
Négatif :
187 000
CC totaux : facteurs infectieux
PM
pm
PM
pm
Variations :
• En fonction de l’évolution de l’infection (Bv, Ov, Cp) :
o Guérison bactériologique et ¢re
o versus Chronicité clinique (fibrose, abcès)
o versus …
Van Werven et al., 1997
Seuil de
dépistage
(Infections intra-
mammaire)
CCS
Dopfer et al., 2000
CC totaux : facteurs infectieux
Exemple :
Strepto-
coques
Exemple :
E. coli
38
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
1 cycle
Recrutement cellulaire (neutrophiles)
par vagues successives :
Gram+ > Gram –
Quartier : CCS (x 1000 cell/ml)
Jours
Quartier : UFColonies /ml
Durée moyenne des cycles : 3-7 jours
(en fonction de la vache, du germe)
• F. sinusoïdales : précoces, durables, régulières, d’amplitude forte et de période faible
• CCS et bactéries : F. concomitantes, mais asynchrones
o versus Chronicité subclinique : fluctuations (F)
CC totaux : facteurs infectieux
Exemple :
Staphylocoques
39
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
1/2 cycle
Quartiers : CCS (x 1000)
Jours
Quartiers : UFC /ml
Faux-négatifs
potentiels en
fonction du seuil
et nombre de
répétitions.
Bactériologie :
idem
(lait cru !)
Durée moyenne des cycles : 3-7 jours
 Pour diminuer les faux-négatifs :
reprélever un ½ cycle + tard : ± 2 à 4 jours
(CCS => CMT)
Seuil de
dépistage
CC totaux : facteurs infectieux
40
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
Quartiers : CCS (x 1000 cell/ml)
Jours
Quartiers : UFC /ml
Mammites chroniques : même signification biologique
de 1 et +/- 30 millions cell/ml : neutrophiles majoritaires
Seuil inférieur
 Utiliser le nombre de dépassements de 2 seuils
(et non les données brutes)
Seuil supérieur
CC totaux : facteurs infectieux
41
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
J1
J3
J5
J7
J9
J11
J13
J15
J17
J19
J21
J23
J25
J27
J29
J31
J33
J35
J37
J39
J41
J43
J45
J47
J49
Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml)
Quartiers : CCS (x 1000 cell/ml)
Jours
Quartiers : UFC /ml
Comptages cellulaires différenciés ?
Seuil inférieur
 utiliser le nombre de
dépassements de 2 seuils
Seuil supérieur
RÈGLE DE DÉCISION (classique et encore valide) :
Pour le suivi du statut infectieux des mamelles
(≠ dépistage) :
= gestion sanitaire a posteriori (plusieurs mois) :
Nombre de dépassements de :
- seuil inférieur = 250 000 cell/ml
- seuil supérieur = 800 000 cell/ml
par exemple ; en fonction des objectifs :
sensibilité ou spécificité privilégiée.
CCS :
o toujours < 250 000 : présumée “saine”
o au moins 2 > 800 000 : “infectée”
= “infectée durable” ou “récidivante”
o autres cas : “douteuse”
dont “infectée brève”
CC totaux : facteurs infectieux
MQC-C (Milk Quality Control – Cell count) :
Mesure de la viscosité du mélange lait + réactif (principe du CMT, automatisé)
Intervalles entre
pics (jours)
6 7 6 6 6 7 6 // 6 7 8 6 6
de 6 à 7 jours (3 mois)
Exemple visuel en robot de traite
Evaluations cellulaires de périodicité
ajustable : toutes les traites,
tous les jours, …
CC totaux : facteurs infectieux
+
Fortes fluctuations cellulaires sur des
intervalles très courts à long (lactation)
 utiliser plusieurs valeurs successives
Distribution bimodale
seuils à adapter en fonction de l’objectif
Négatives Positives
Statut bactériologique
des mamelles
Distribution
des mamelles
Seuil
inférieur
Seuil
supérieur
Les problèmes et les solutions de principe (Bv, Ov, Cp)
Comptages cellulaires totaux : utilisation
 3 classes et 2
N
+
Négatives Positives
Statut bactériologique
des mamelles
Distribution
des mamelles
Seuil
inférieur
Seuil
supérieur
Faux –
• fluctuations
• pathogènes mineurs
+/- effets combinés
N
Comptages cellulaires totaux : utilisation
Nature des faux-positifs et faux-négatifs : synthèse
Faux +
Effets, parfois combinés, de:
• début de lactation, L1
• stress thermique,…
• fin de lactation, vieille VL
(+ traite du soir)
• Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
45
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Macrophages Phagocytose par Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
Sécrétion
accrue d’Ac
opsonisants
Activation du
complément
par Ac
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
4 types principaux de cellules : fonctions
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % si
quartiers sains
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Adapté selon Zaatout et al., 2020 46
Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Phagocytose par Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- en poste ou en
patrouille
Fort % si
quartiers sains
Macrophages
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % si
quartiers sains
47
Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Leucocytes
“résidents”
Macrophages
• Polymorpho-
nucléaires
Neutrophiles :
- Phagocytes
professionnels
majeurs
Très fort % +++
si infection
Leucocytes
“migrants”
(récents)
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- en poste ou en
patrouille
Fort % si
quartiers sains
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % ++
si quartiers sains
48
Réponse immunitaire “innée” :
Réponse immunitaire “adaptative” :
• Détection des bactéries
• Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
• Phagocytose par :
Neutrophiles
Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire
Bactérie
Anticorps
¢ épithéliale endommagée
Bactérie
Toxines, enzymes…
Macrophages
• Cellules
épithéliales :
- sentinelles IIres
- ingestion de
bactéries,…
¢ mammaires,
constitutives,
non
inflammatoires
(lactifères ou
sécrétrices)
Très faible %
• Neutrophiles :
- Phagocytes
professionnels
majeurs
Très fort % +++
si infection
Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques
Leucocytes
“résidents”
Leucocytes
“migrants”
(récents)
Sécrétion
d’anticorps
Activation du
complément
• Lymphocytes :
- ¢ mémoires
- régulation de la
réponse bactéricide
- production d’Ac
- L¢ en poste ou
en patrouille
Fort % si
quartiers sains
• Macrophages :
- ¢ sentinelles :
initiateurs de
la réponse
- phagocytes
“amateurs”
Très fort % ++
si quartiers sains
• Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Cytométrie de flux
• Microscopie
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
Conclusion
50
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
Plusieurs paramètres
analysables pour
chaque ¢
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
Cytométrie de flux
= technique d’identification, voire de caractérisation, des cellules (avec quantification)
• Marquage cellulaire : > indifférencié : colorants de l’ADN (CCS ou CCD)
> différencié :
Anticorps
monoclonaux
couplés à
un fluorochrome
Des populations
Un état de diffé
Technologie qui permet d’identifier e
manière quantitative et qualitative des po
Présence de
surface des cel
(CD, cluster de
Ces marqueurs permettent de distinguer:
La cytométrie en flu
Marquage spécifique
d’antigènes leucocytaires
de surface
 Différenciation cellulaire fiable et utile
 Non disponible en automate haut débit à ce jour (?)
(selon informations disponibles)
• Diffraction dans l’axe : taille des ¢
• Diffraction latérale : granularité des ¢
Laser
Cellule
Filtres, miroirs
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Caractérisation
cellulaire
o Marquage
spécifique (1 à 4)
o Caractères
physiques
des ¢
Granularité => différenciation (présomptive)
Taille
Détecteurs
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Compteur disponible en LIAL pour CCD : Fossomatic® 7 DC
DE
MACROPHAGES
N°
20
s
Débris
(bruit de fond)
Base technique de la
différenciation cellulaire utilisée
(brevet)
Flux
cellulaire
Granularité
Canal de fluorescence 2
Canal de fluorescence 1
Coloration (ADN) : acridine orange
Sous-populations
cellulaires
différenciées Neutrophiles +
Lymphocytes
Macrophages
¢ somatiques
• Comptages (absolus et relatifs %) :
o leucocytaire total (sans ¢ épithéliales)
o 3 types majeurs différenciés :
- lymphocytes
- macrophages
- neutrophiles
• Intérêt d’utiliser des ratios, quelle que soit la méthode :
Comptages cellulaires différenciés : Techniques
Decoding the immune system for earlier
more accurate detection
Modeled after the blood leukocyte differential, a test
routinely used in humans and companion animals
to detect infection, QScout®
MLD identifies and
differentiates leukocytes (white blood cells) in milk. Each
of the three white blood cell types (described below and
shown in Figure 1) play a key role in fighting infection, a
each has a different function in the immune system.
Scout inf ec
Figure 1. Fluorescent imaging differentiates cell types
Zoetis
Microscopie à fluorescence :
CCD
par
quartier
Microscopie à fluorescence et reconnaissance d’images
o Opposer 2 groupes de variations inverses :
 ¢ résidentes, pré-inflammatoires : Macrophages, Lymphocytes
 ¢ inflammatoires survenant massivement lors de mammite : Neutrophiles
o Ratio Neutrophiles / Lympho¢ (bien corrélé à bactériologie), ou Neutrophiles / Macrophages
- de laboratoire
- portative
(Gonçalves et al., 2017)
• Comptages cellulaires totaux
• Comptages cellulaires différenciés : Bases
• Comptages cellulaires différenciés : Techniques
• Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ?
• Facteurs non infectieux de variation
• Facteurs infectieux de variation
• Performances diagnostiques connues
Conclusion
55
Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
Plan – Partie 2
CCD : Facteurs non infectieux de variation
Stade et rang de lactation principalement
Etude Italie 2020 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses
• Durée : 23 mois (CL)
Zecconi et al., 2020
% L¢ + Neutrophiles en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS
Stade de L. :
élévations (p<0,001)
- en début de L.
- fin : VL âgées
Ex des L3 :
∆ 10% entre
début et fin
< 50 000 cell/ml :
 L¢ ++, PMNN -
?
CCD : Facteurs non infectieux de variation
Etude Italie 2020 (CL) :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses
• Durée : 23 mois
% L¢ + Neutrophiles pour des CCS en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS
Interactions stade x rang de L. et stade x CCS
Rang de L. :
(p<0,001)
- à CCS égaux et
faibles, et stade
de L. fixé, % +
élevés chez
L1 surtout,
puis L ≥ 4
- L1 : CCS les +
faibles et CCD
les + élevés
Stade et rang de lactation principalement
 Cellularité particulière
des L1
CCD : Facteurs infectieux de variation
Sous-populations cellulaires
en fonction des CCS
Damm et al., 2017
• Autres :
pentes + fortes
- Macrophages : décroissance
- Neutrophiles : augmentation
Microscopie à fluorescence
(comme référence par rapport au 7 DC)
1ère étude sur Foss® 7 DC :
• Technique : microscopie
• N=293 laits
• Etude non indépendante
• A confirmer (dans diverses situations
physiologiques, bactériologiques,…)
• Lymphocytes (%) :
avec l’augmentation des CCS,
décroissance :
- de pente faible
- entre 20 et 1%
CCD : Facteurs infectieux de variation
Sous-populations cellulaires
en fonction des types de
bactéries pathogènes
Kirkeby et al., 2019
• La dispersion des % dans
l’intervalle log 4-6 paraît assez
proche entre :
- “No pathogens” : 32-81%
- “PMajeur” : 33-88%
- “pmineur” : 33-84%
• A préciser
Etude Danemark 2019 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs : 2 élevages, 3800 analyses
• Durée : 1 an (CL)
• Etude non indépendante
Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur
prédictive
positive
Valeur
prédictive
négative
CCD : Performances diagnostiques ?
Performances des CCS et de l’association CCS + CCD
Etude Québec 2020 :
• Technique : Foss® 7DC
• Effectifs * : 11 élevages,
4 CL successifs (1107 CL)
bactériologie : composite
• Bactériologie (1 seule) :
- négatif : 17%
- PM ** : 13%
- pm : 62%
• Etude non indépendante
• CCS seuls
(Schwarz et al., 2020)
Pas d’étude indépendante (avec même technique).
Peu d’études comparatives de qualité.
Choix de l’étude québécoise récente comme exemple car :
- assez large * ; conditions du terrain (données de CL)
- mais ne présentant que les résultats relatifs aux PM ** (fréquent)
Bon compromis
(si seuil par défaut)
Mauvaise sensibilité
Mauvaise
à médiocre
Très
bonne
Invariables Dépendant de la prévalence
CCD : Performances diagnostiques ?
Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur
prédictive
positive
Valeur
prédictive
négative
encore +
mauvaise
à médiocre
très
Très bonne
Sensibilité
améliorée
Spécificité
détériorée
*
26 à 36% des mamelles
bactério – présentent
un % Neutrophiles
+ L¢ élevé
*
Performances en englobant les pathogènes mineurs ?
• Association CCS + CCD
61
Bilan, conclusion
62
• Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion
o Performances bien connues
 Paramètre historique, « indétrônable » (paiement du lait)…,
mais assez peu adapté à 1 discrimination précise des mamelles
selon leur statut infectieux, car au moins 3 limites significatives :
 Donc à utiliser en connaissant ses limites :
- ≠ outil de Diagnostic (certitude)
- mais = Dépistage de masse (de 1ère intention)
Faux-positifs Facteurs de variation non infectieux
Faux-négatifs “Pulsatilité” des CCS – pathogènes mineurs
Bilan, conclusion
63
o Périodes-clefs : antibiothérapie HL ciblée (nouveau Règlement UE 2022)
 S’appuyer sur la VPN, en valorisant plusieurs CCS : 85% à 96% (fonction des études)
 obturateurs de trayons
 Reste du troupeau = quelques rares “douteuses” + infectées
 ABthérapie HL à visée curative, avec spécialités à persistance moyenne
 Plus généralement (HL et en lactation) :
associer plusieurs analyses, décalées dans le temps (fluctuations),
et si possible de nature différente :
 évaluations cellulaires fréquentes (robots)
 conductivité par quartier (en ligne) à interpréter en relatif
 bactériologie (simplifiée, mais optimisée)
 CCD,…
• Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion
• Comptages cellulaires différenciés : Bilan d’étape
o Principe très intéressant dans le “paysage diagnostique” actuel,
encore assez pauvre, mais en évolution
o Déclinaison commerciale disponible :
 Intérêt +++ : haut débit
 Physiologiquement :
par rapport aux CCS, 2 à 3 difficultés persistent : F. de V. non infectieux, “pulsatilité” (pm ?)
 Techniquement :
différenciation cellulaire partielle (2 groupes)
 Etudes complémentaires nécessaires (labo + élevages) :
- F. de variation à préciser : liés aux VL, bactéries et élevages (seuils à adapter)
- études longitudinales
o Utilisation 1 : dépistage optimisé par l’amélioration de la sensibilité (70% à 88%)
 Faux + donc bactériologie simple de confirmation (cas les + douteux)
o Utilisation 2 : évaluation de l’efficacité des traitements (Ecoantibio) : + précise, + rapide ?
o Utilisation 3 (moyen terme) : phénotype possible pour sélection génétique
Bilan, conclusion

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Le diagnostic de troupeau, étape-clef de la maîtrise des mammites

  • 1. D. BERGONIER ENV Toulouse UMT IDELE – ENVT – INRAe « Pilotage de la santé des ruminants » UMR INRAe – ENVT 1225 « Interactions hôtes – agents pathogènes » Le DIAGNOSTIC de TROUPEAU, étape-clef de la maîtrise des MAMMITES : voies d’AMELIORATION, apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES 8.12.2021
  • 2. • Repères méthodologiques • Diagnostic descriptif (“documentaire”) • Comptages cellulaires individuels • Mammites cliniques • Modélisation • Diagnostic bactériologique Plan 2 Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
  • 3. Introduction : définitions Définition opérationnelle des mammites : inflammations mammaires “monobactériennes” dont la maîtrise pratique s’appuie en 1er lieu sur la différenciation de groupes de germes selon leurs réservoirs et modes de transmission Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition èle de traite Situation saine Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Modèle d'association Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine “Modèles” épidémiologiques de transmission “ ” Modes de transmission mixtes : - soit réels : assez fréquent pour des périodes longues - soit proposés par défaut… Profils-types extrêmes, mais réels
  • 4. Introduction : définition Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition èle de traite Situation saine Figure 26 : Evolution des mammites dans un élevage (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'environnement Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Figure 26 : Evolution des mammites dans un él (61) IV. Diagnostic Modèle d'association Modèle d'exposition Modèle de traite Situation saine Entérobactéries E. coli Klebsiella sp. Enterobacter Serratia sp.,… Streptocoques S. uberis E. faecium E. faecalis,… (SCN : certaines espèces ?) S. aureus Mycoplasmes S. agalactiae … Staph. coag. – Corynébactéries Strep. dysgalactiae Strep. uberis,… • Autres bactéries : transmission non spécifique par la traite • Transmis par la traite Germes : • “Contagieux” 4 Bactéries associées
  • 5. Objectifs : • caractériser les mammites • +/- proposer un “modèle” Etape 2 : diagnostic bactériologique Etape 1 : (pré-)diagnostic descriptif Etape 3 : diagnostic analytique Diagnostic de troupeau : repères méthodologiques - Modes de transmission : en fait complexes et souvent peu spécifiques - Diversité microbienne - Nécessaire bonne connaissance des bactéries (traitement, vaccins,…) - Origine polyfactorielle - Importance de la prévention,…  Contemporain et Rétrospectif Zootechnique et Bactériologique Bilan diagnostique complet, systémique et explicatif Analyse des facteurs de risque Orientation clinique et épidémiologique Développer un diagnostic global de troupeau reposant sur la complémentarité de 3 approches Etape probabiliste, mais exhaustive et rétroactive 2 étapes de confirmation des hypothèses et d’approfondissement Explicative a posteriori, probabiliste Informations certaines, mais instantanées et trop restreintes (3 étapes) (l’élevage en entier) (base du plan d’action)
  • 6. Diagnostic descriptif : indicateurs Etape 1 : (pré-)diagnostic descriptif Etape 2 : diagnostic bactériologique Etape 3 : diagnostic analytique  Indicateur de prévalence collective (troupeau) et d’évaluation de l’efficacité des mesures de maîtrise : • Comptages cellulaires de tank (car paiement, mais limites significatives) • Autres marqueurs possibles :  Indicateurs d’incidence et de prévalence individuelles et de caractérisation épidémiologique… • Comptages cellulaires individuels • Autres marqueurs possibles (enzymes, cathélicidines,…) • Critères complémentaires actuels : - conductivité électrique (en ligne et par quartier) - robots : évaluations cellulaires, autres marqueurs à venir… (non bactériens) - comptages cellulaires différenciés  Indicateurs cliniques (et d’évaluation de l’efficacité des traitements) • Mammites cliniques Diagnostic d’orientation reposant sur 3 types d’indicateurs (à ce jour) - spécifiques (existant : agents contagieux quantifiés) - non spécifiques (biomarqueurs mammaires, SMIR,…) 6
  • 7. Diagnostic descriptif : voies d’amélioration possibles Optimiser nos pratiques Améliorer les outils récents et leur utilisation Evaluer les nouveaux outils Prévalence collective : Incidence et prévalence individuelles : Mammites cliniques : Indicateur de : • CCT : meilleure valorisation ciblée • CCI : indicateurs • CCI : logiciels,… • Enzymes : LDH,… • Comptages cellulaires différenciés • Robots : autres marqueurs - spectroscopie proche IR - bio-capteurs,… • Tank : identification des vaches cellulaires (génotypage) • enregistrements : exhaustifs et complets • indicateurs 7 … …
  • 8. Indicateurs épidémiologiques de base Domaine Indicateur Marge de progrès Modèle épidémiologique Taux d’atteinte : • ensemble des infections (P) • nouvelles infections (I) Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem) Incidences mensuelles : N et % CCI > 300 000 * (mois N) et < 300 000 (N-1) Répartition : incidence mensuelle en fonction de stade de L., rang de lactation,… x Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x Période sèche Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x) Indice de nouvelles infections : % VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000) xx x Comptages cellulaires individuels : indicateurs Importance : gras ++ gras et souligné +++ * Seuil à affiner – Cf infra Privilégier les indicateurs d’incidence différenciée (“répartition”,…), par période-clef (indicateurs “dynamiques”) (Cf tableau diapo 14)
  • 9. Indicateurs épidémiologiques de base Domaine Indicateur Marge de progrès Modèle épidémio Bactério ciblée Taux d’atteinte : • ensemble des infections • nouvelles infections Prévalence globale (12-18 mois) : % CCI > 300 000 * xx Prévalences mensuelles pour L1, multipares (idem) Incidences mensuelles : N et % CCI > 300 000* (mois N) et < 300 000 (N-1) Répartition : incidence mensuelle en fonction de stade de L., rang de lactation,… x Persistance Nombre de CCI > 300 000 * x Récidives (séparées par 2 CL < 200 000) x Période sèche Indice de guérison : % VL CCI > 300 av. => < 300 apr. xx x(x) Indice de nouvelles infections : % VL CCI < 300 avant => > 300 après (L1: 200 000) xx x Comptages cellulaires individuels : indicateurs • • • - Prévention ou Elimination ? - Lactation ou Période Sèche ? - situation des L1 ? Questions – clefs : 9
  • 10. • Caractérisation des mammites cliniques • Indices d’infections en période sèche Comptages cellulaires individuels : logiciels,… 10 • Caractérisation cellulaire
  • 11. …… 11 CCI : logiciels, plates-formes digitales
  • 12. Objectifs Mammites cliniques : marges de progrès • Améliorer la détection détection en ligne, conductivité, 1ers jets, filtres… • Enregistrer toutes les mammites quelque soit la sévérité, le traitement ou pas,… • Caractériser les cas : - identification : vache et quartier - ordre : 1er cas, rechute ou récidive - sévérité clinique - traitements - … • Résultat bactériologique Grade 1 : lait modifié (grumeaux,…) Grade 2 : signes mammaires en plus (aigus : rougeur, chaleur, douleur, tuméfaction) Grade 3 : signes généraux en plus Gradation clinique simple Exemple de grille à 3 grades
  • 13. Domaine Indicateur Marge de progrès Modèle épidémio Bactério ciblée Taux d’atteinte “Incidence” clinique totale (ordre 1 et +) globale (12 mois) : N de cas /100 VL présentes /an xx N de cas clinique / VL atteinte : N cas / N VL avec au moins 1 cas x Répartition Incidence (ordre 1 et +) en fonction de : stade de L., rang de L., mois x Gravité % de cas avec signes généraux (grade 3) x x Fluctuations, guérison Taux de CCI > 300 000 avant le cas clinique x Taux de CCI < 300 000 après cas clinique (30-60 jrs) x Récurrences Taux de rechute clinique après traitement (%) xx x Taux de récidive clinique (définir quartiers) • Prévention ou Elimination • • • Indicateurs épidémiologiques de base Mammites cliniques : indicateurs 13 Importance : gras ++ gras et souligné +++ (Cf tableau dia 14)
  • 14. Etape 1 : diagnostic descriptif 14 Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites Période Principaux critères Traite Environ- nement Lactation Taux d’atteinte Prévalence globale : % CCI > 300 000 cell/ml > 25 < 15 Incidence clinique totale globale : nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an < 25 > 25 Mammites cliniques CCI avant phase clinique : % cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml > 65 < 30 Gravité clinique : % cas avec signes généraux < 5 > 15 Nombre de cas cliniques par vache atteinte : nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas > 1,5 < 1,2 Indice de guérison des cas cliniques : % cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours < 50 > 75 Période sèche Mammites subcliniques Indice de guérison : % VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml < 50 > 70 Indice de nouvelle infections : % VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml < 10 > 20 Référentiel SNGTV, 2013 • Différenciation Traite – Environnement • puis sous-modèles Formulation d’hypothèse(s) opérationnelle(s)
  • 15. 15 Période Critère Traite Environ- nement Lactation Taux d’atteinte Prévalence globale : % CCI > 300 000 cell/ml > 25 < 15 Incidence clinique totale globale : nombre de cas cliniques /100 VL présentes /an < 25 > 25 Mammites cliniques CCI avant phase clinique : % cas avec CCI avant > 300 000 cell/ml > 65 < 30 Gravité clinique : % cas avec signes généraux < 5 > 15 Nombre de cas cliniques par vache atteinte : nombre de cas / nombre de VL avec au moins 1 cas > 1,5 < 1,2 Indice de guérison des cas cliniques : % cas avec CCI < 300 000 cell/ml entre 30 et 60 jours < 50 > 75 Période sèche Mammites subcliniques Indice de guérison : % VL avec CCI > 300 000 => < 300 000 cell/ml < 50 > 70 Indice de nouvelle infections : % VL avec CCI < 300 000 => > 300 000 cell/ml < 10 > 20 CONDITIONS pratiques d’optimisation du diagnostic d’orientation : Pour gagner en précision et efficacité (limiter les hypothèses indifférenciées par défaut, de type “modèle d’association”) : • Restreindre à l’intervalle de temps associé à l’épisode à caractériser (limiter le recouvrement) • Exclure les principaux facteurs de confusion : - anciennes mammites chroniques (incurables) - confusion entre rechute et récidive - vache à 3 quartiers - utilisation améliorée des CCI avant-après période sèche (cf diapo 35) - … • Avoir des données complètes : - mammites cliniques récentes (± guérison inconnue),… - enregistrements complets des mammites cliniques - … Diagnostic descriptif – Finalisation : “modèle” de mammites
  • 16. • Repères méthodologiques • Diagnostic descriptif • Diagnostic bactériologique Plan – Partie 1 Voies d’AMELIORATION du DIAGNOSTIC de TROUPEAU
  • 17. Etape 1 : diagnostic descriptif Etape 3 : diagnostic analytique Etape 2 : diagnostic bactériologique Contraintes, limites : 1. CONTAMINATION des prélèvements 2. Résultats faussement négatifs : Sans optimisation culturale : - mammites subcliniques : 25-35% - mammites cliniques : 5-18% 3. Coût 4. (Relative lenteur de certaines analyses ?) … A développer ! Diagnostic bactériologique : contraintes 17
  • 18. Etape 1 : diagnostic descriptif Etape 3 : diagnostic analytique Etape 2 : diagnostic bactériologique Diagnostic bactériologique : solutions Solutions actuelles : (domaine évolutif) 1. PCR multiples : Progrès technologique très intéressant, mais : - multi-positivités fréquentes : faux-positifs ++ car sensibilité analytique +++, détection des bactéries vivantes et mortes, et contamination fréquente des prélèvements - pas de témoin de contamination - PCR “fermées” (liste préexistante de cibles) À réserver à certaines utilisations particulières (et prélèvements rigoureusement aseptiques) Contraintes, limites  18 PCR traditionnelle PCR multiple x 3-4
  • 19. Diagnostic bactériologique : solutions 2. Culture conventionnelle (en laboratoire), identification par spectrométrie de masse (MALDI-TOF *) Signature protéique des bactéries * MALDI-TOF : Matrix-Assisted Laser Desorption/ionisation - Time Of Flight • Fiabilité (discrimination) • Rapidité • Facilité • Coût +/- inchangé • Futur : antibio- résistance, pathotypage possibles (en partie) (Très) bonnes performances : Etape 2 : diagnostic bactériologique Solutions
  • 20. Diagnostic bactériologique : solutions 3. Culture et diagnostic “présomptif” : - méthode simple et rapide, - modulable : identifications +/- poussées • simplicité, rapidité • coût réduit • donc bonne adaptation au contexte actuel : résultats bactériologiques nécessaires pour l’antibiothérapie, la vaccination, la maîtrise,… • association de milieux de culture : - pertinente : complémentarité des milieux chromogènes électifs, sélectifs (+ TSS) - adaptée à l’objectif : types de bactéries recherchées,… • conditions de culture • connaître les limites (vérifications Maldi-Tof, contrôle qualité,…) • … Solutions Etape 2 : diagnostic bactériologique Intéressante en particulier si optimisée : Plusieurs avantages : 20
  • 21. Diagnostic bactériologique : solutions 4. Culture et diagnose d’orientation : identification présomptive de certains groupes de germe Solutions Etape 2 : diagnostic bactériologique Staph Coliformes PetriFilm® Géloses compartimentées Limites : • Certains germes non mis en évidence (PetriFilm® : streptocoques,…) • Témoin de contamination ? • simplicité et coût réduit : PetriFilm® utilisé en élevages (USA,…) • rapidité • sélectivité intéressante de certains milieux VétoRapid® Atouts : 21 Milieu gélifié et déshydraté Autres : Entérobactéries, E. coli,…
  • 22. Un diagnostic de troupeau approfondi… … base de l’adaptation et de l’efficacité des plans d’action Etape 2 : diagnostic bactériologique Etape 1 : pré-diagnostic documentaire Etape 3 : diagnostic analytique Evaluation du rapport coût / bénéfice. Suivi régulier. Bilan diagnostique complet, systémique, explicatif PRÉVENTION des nouvelles infections ELIMINATION des infections existantes Plan d’action Etiologiquement adapté, Techniquement efficace, Economiquement rentable - Traitement en lactation - Traitement HL - Réforme ciblée - (tarissement anticipé,…) - Correction des facteurs de risque - Amélioration additionnelle des pratiques - Obturation des trayons HL - +/- Immuno-stimulation : vit.-OE, vaccin,… - Biosécurité, Génétique,…
  • 23. • Comptages cellulaires totaux (conventionnels) : intérêts et limites pratiques • Méthode • Facteurs de variation non infectieux • Facteurs de variation infectieux • Utilisation • Comptages cellulaires différenciés : Bases • Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ? Conclusion Plan – Partie 2 23 Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
  • 24. Méthode de référence (M. opto-fluoro-électronique) (ISO13366-2 – IDF148-2) Comptages cellulaires totaux (conventionnels) 2. Dénombrement : intensité de fluorescence Messung Quantification de la fluorescence émise Cytométrie de flux Cellules alignées Stimulation des ¢ par lumière de longueur d’onde spécifique 24 Laser 1. Coloration fluorescente de l’ADN des noyaux (bromure d’éthidium) : o leucocytes et ¢ épithéliales : - Bv, Ov : < 5-7% - Cp : % parfois supérieur o ¢ viables et ¢ mortes (ou apoptotiques)  2 caractéristiques communes aux comptages différenciés actuels (cytométrie de flux)  Performances : répétabilité fonction de la gamme écarts-types tolérés de 10% (< 150 000) à < 3% (> 1,5.106 cell/ml)
  • 25. Méthode OFE : déclinaisons actuelles Ordre décroissant de fréquence d’utilisation : Quantification de l’ADN nucléaire - Laboratoires (LIALs) : compteurs automatisés de haut débit • de 1ères générations : comptage (c.) indifférencié • de dernière génération : c. différencié (Foss® 7DC) - Robots : • OCC (DeLaval) - Compteurs portatifs : • DCC (DeLaval Cell Counter) • [RT10 et application iPhone : compteurs de poche – DeLaval] DCC Comptages cellulaires totaux Foss® 7DC RT10 (2015) 25
  • 26. 1. Infections intra-mammaires (actualité et histoire infectieuses) Facteurs de variation des comptages cellulaires (base de leur utilisation) Comptages cellulaires totaux 2.1. Facteurs physiologiques : • Rang de lactation • Stade de lactation • Variations journalières • Intervalle entre traites (soir > matin) • Fractions du lait (alvéolaire > autres) • … 1. Facteurs de variation infectieux 2. Facteurs de variation non infectieux carrière année journée traite ½ journée Temporalités : Impact Principes communs aux CCS totaux et CCD (différenciés) – Cas des CCS totaux (vache) : décroissant
  • 27. 1. Infections intra-mammaires Comptages cellulaires totaux 2.1. Facteurs physiologiques : • Rang de lactation • Stade de lactation • Variations journalières • Intervalle entre traites (soir > matin) • Fractions du lait (alvéolaire > autres) • … 2.2. Facteurs zootechniques ou sanitaires : • transitions : conduite et/ou alimentation • autres modifications de l’environnement : stress thermique, météo (autre), isolement, surtraite, baisse de production, vaccin,… • affections intercurrentes (BVD,…),… • [monotraite] 2.3. Facteurs génétiques : • Héritabilité : vache : 0,10 – 0,17 1. Facteurs de variation infectieux 2. Facteurs de variation non infectieux INTERACTIONS • entre facteurs non infectieux • effets physiologiques plus marqués chez les femelles infectées Facteurs de variation des comptages cellulaires (vache)
  • 28. 1. Inf. intra-mammaires + CAEV, (Maedi), mycoplasmes Comptages cellulaires totaux 2.1. Facteurs physiologiques : • Rang de lactation • Stade de lactation ++ • Variations journalières • Intervalle entre traites (soir > matin) • Fractions du lait (alvéolaire > autres) • Nombre d’agneaux allaités (+ traite) • Mois de mise bas • Œstrus,… 2.2. Facteurs zootechniques (ou sanitaires) ++ • transitions (conduite, alimentation) : mise à l’herbe • autres modifications de l’environnement : météo, baisse de production, vaccin, (surtraite),… • affections intercurrentes (BD, parasitose,…),… 2.3. Facteurs génétiques : • Héritabilité : Brebis : 0,11 – 0,15. Chèvre : 0,20 – 0,24 1. Facteurs de variation infectieux 2. Facteurs de variation non infectieux Facteurs de variation des comptages cellulaires : petits ruminants Particularités ovines Particularités caprines : facteurs + diversifiés et souvent d’effet + marqué (et interactions)
  • 29. 29 Stade de lactation (jours) Score moyens mensuel de CCI Rupp et al., 2000 Score CCS (¢/ml) Facteurs physiologiques : stade et rang de lactation (vache) Comptages cellulaires (CC) totaux : facteurs non infectieux Début de lactation : 2 facteurs - brève augmentation physiologique (< 6 jrs) - nouvelles infections vraies, furtives : SCN,… (L1 surtout). Ovins, caprins : idem Fin de lactation : effet “concentration” Score log = log2 (CCS/100 000) + 3 Ensemble des CCI des vaches P’Holstein, France, 1997 Apport des CCDifférenciés ? CDD ?
  • 30. 30 Stade de lactation (jours) Score moyens mensuel de CCI Rupp et al., 2000 Score CCS Stade de lactation : quantitativement CC totaux : facteurs non infectieux Fin de lactation : effet “concentration” P’Holstein, France, 1997 L2 (par exemple), fin : hausse de +1,7 log, soit de 50 000 à 150 000 cell/ml en moyenne L1, début : – 1,3 log, soit de 120 000 à 50 000 cell/ml en moyenne
  • 31. Stade de lactation (jours) Score moyens mensuel de CCI Rupp et al., 2000 Rang de lactation : quantitativement Effet Rang en fin de lactation : +1,6 log, soit de 95 000 à 270 000 cell/ml en moyenne  Traitement HL sélectif : adapter les seuils ! P’Holstein, France, 1997 CC totaux : facteurs non infectieux
  • 32. 32 Stade de lactation (jours) Score moyens mensuel de CCI Interaction globale Stade x Rang de L. : + 2,7 log, soit de 50 000 à 270 000 cell/ml en moyenne  Faire varier les seuils en fonction des rangs et stade de L. des vaches Rupp et al., 2000 Stade et rang de lactation : interaction P’Holstein, France, 1997 32 Score CCS CC totaux : facteurs non infectieux
  • 33. Figure 5. Median foremilk SCC for quarters sampled between 0 and 4 days after calving, categorised by pathogens present: No Growth, n = 5577 samples; Minor pathogens (i.e. CNS or Corynebacterium spp.), n = 235; Staph. aureus or other mixed major pathogens, n = 51; and Strep. uberis, Strep. dysgalactiae or E. coli, n = 158. Cows at very low yields will start to show signs of accelerated involution, whereby the concentration of somatic cells being released into the milk increases, in the absence of infection. This is shown clearly by the changes in ICSCC for two members of an identical twinset (Figure 6), which remained uninfected up until dry off. One member produced more than 5 Technote 16 discusse of milk SCC before dry Stade de lactation : période critique du post partum New Zealand Technote 12 (2012) N = 5577 N = 235 N = 51 N = 158 Médianes des CCS de quartiers prélevés entre J1 et J4 post partum De 600 000 à 150 000 cell/ml en 4 jours (médiane) Infections à SCN de début de lactation : - persistance + faible - (CCS + faibles cf infra) Echelle log PM pm (pm): SCN,… Effectifs : CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
  • 34. Conséquences : période sèche Améliorer l’évaluation continue de la dynamique des infections : o Adapter les seuils de CCS : fonction du rang de L.,… o Intervalles entre prélèvements et tarissement ou MB : - élevages à problèmes : pouvoir proposer des prélèvements mieux ciblés pas dans 2-3 dernières semaines (fin de L.), ni les 8-10 premiers jrs post partum - CCS +/- CCD o Différencier Persistance vraie (= échec) versus Guérison puis Nouvelle Infection : - conductivité par quartier (en ligne) o Différencier les résultats en fonction des traitements : AB1 vs. AB2 vs. Obturateur BILAN CELLULES MAMMITES Exemple CC totaux : facteurs non infectieux et infectieux
  • 35. • Comptages cellulaires totaux (conventionnels) : intérêts et limites pratiques • Méthode • Facteurs de variation non infectieux • Facteurs de variation infectieux • Utilisation • Comptages cellulaires différenciés : Bases • Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ? Conclusion Plan – Partie 2 35 Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES
  • 36. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 C o l i f o r m e s S t r e p . a g a l a c t i a e S t r e p . u b e r i s S t r e p . d y s g a l a c t i a e S . a u r e u s C o r y n e b a c t e r i u m b o v i s S t a p h y l o c o q u e s c o a g . m o i n s Moyennes arithmétiques Moyennes géométriques 0 5 10 15 20 C o l i f o r m e s S t r e p . a g a l a c t i a e S t r e p . u b e r i s S t r e p . d y s g a l a c t i a e S . a u r e u s S t a p h y l o c o q u e s c o a g . m o i n s C o r y n e b a c t e r i u m b o v i s Facteur multiplicatif Variations : • En fonction des bactéries (Bv, Ov, Cp) Intensité du recrutement cellulaire moyen (vache) (Djabri et al., 2000 – Méta-analyse: 20 publications) 17 13 9 5,7 5 1,5 2 CCS (x1000) cell/ml  Faibles ≠ entre pathogènes mineurs (pm : SCN, corynébactéries,…) et négatifs ou fin de lactation : confusion possible  CCD ? 36 (quartiers) 475 000 Négatif : 187 000 CC totaux : facteurs infectieux PM pm PM pm
  • 37. Variations : • En fonction de l’évolution de l’infection (Bv, Ov, Cp) : o Guérison bactériologique et ¢re o versus Chronicité clinique (fibrose, abcès) o versus … Van Werven et al., 1997 Seuil de dépistage (Infections intra- mammaire) CCS Dopfer et al., 2000 CC totaux : facteurs infectieux Exemple : Strepto- coques Exemple : E. coli
  • 38. 38 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 J21 J23 J25 J27 J29 J31 J33 J35 J37 J39 J41 J43 J45 J47 J49 Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml) 1 cycle Recrutement cellulaire (neutrophiles) par vagues successives : Gram+ > Gram – Quartier : CCS (x 1000 cell/ml) Jours Quartier : UFColonies /ml Durée moyenne des cycles : 3-7 jours (en fonction de la vache, du germe) • F. sinusoïdales : précoces, durables, régulières, d’amplitude forte et de période faible • CCS et bactéries : F. concomitantes, mais asynchrones o versus Chronicité subclinique : fluctuations (F) CC totaux : facteurs infectieux Exemple : Staphylocoques
  • 39. 39 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 J21 J23 J25 J27 J29 J31 J33 J35 J37 J39 J41 J43 J45 J47 J49 Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml) 1/2 cycle Quartiers : CCS (x 1000) Jours Quartiers : UFC /ml Faux-négatifs potentiels en fonction du seuil et nombre de répétitions. Bactériologie : idem (lait cru !) Durée moyenne des cycles : 3-7 jours  Pour diminuer les faux-négatifs : reprélever un ½ cycle + tard : ± 2 à 4 jours (CCS => CMT) Seuil de dépistage CC totaux : facteurs infectieux
  • 40. 40 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 J21 J23 J25 J27 J29 J31 J33 J35 J37 J39 J41 J43 J45 J47 J49 Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml) Quartiers : CCS (x 1000 cell/ml) Jours Quartiers : UFC /ml Mammites chroniques : même signification biologique de 1 et +/- 30 millions cell/ml : neutrophiles majoritaires Seuil inférieur  Utiliser le nombre de dépassements de 2 seuils (et non les données brutes) Seuil supérieur CC totaux : facteurs infectieux
  • 41. 41 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 J21 J23 J25 J27 J29 J31 J33 J35 J37 J39 J41 J43 J45 J47 J49 Excrétion bactérienne (UFC/ml) Comptages cellulaires (milliers cell./ml) Quartiers : CCS (x 1000 cell/ml) Jours Quartiers : UFC /ml Comptages cellulaires différenciés ? Seuil inférieur  utiliser le nombre de dépassements de 2 seuils Seuil supérieur RÈGLE DE DÉCISION (classique et encore valide) : Pour le suivi du statut infectieux des mamelles (≠ dépistage) : = gestion sanitaire a posteriori (plusieurs mois) : Nombre de dépassements de : - seuil inférieur = 250 000 cell/ml - seuil supérieur = 800 000 cell/ml par exemple ; en fonction des objectifs : sensibilité ou spécificité privilégiée. CCS : o toujours < 250 000 : présumée “saine” o au moins 2 > 800 000 : “infectée” = “infectée durable” ou “récidivante” o autres cas : “douteuse” dont “infectée brève” CC totaux : facteurs infectieux
  • 42. MQC-C (Milk Quality Control – Cell count) : Mesure de la viscosité du mélange lait + réactif (principe du CMT, automatisé) Intervalles entre pics (jours) 6 7 6 6 6 7 6 // 6 7 8 6 6 de 6 à 7 jours (3 mois) Exemple visuel en robot de traite Evaluations cellulaires de périodicité ajustable : toutes les traites, tous les jours, … CC totaux : facteurs infectieux
  • 43. + Fortes fluctuations cellulaires sur des intervalles très courts à long (lactation)  utiliser plusieurs valeurs successives Distribution bimodale seuils à adapter en fonction de l’objectif Négatives Positives Statut bactériologique des mamelles Distribution des mamelles Seuil inférieur Seuil supérieur Les problèmes et les solutions de principe (Bv, Ov, Cp) Comptages cellulaires totaux : utilisation  3 classes et 2 N
  • 44. + Négatives Positives Statut bactériologique des mamelles Distribution des mamelles Seuil inférieur Seuil supérieur Faux – • fluctuations • pathogènes mineurs +/- effets combinés N Comptages cellulaires totaux : utilisation Nature des faux-positifs et faux-négatifs : synthèse Faux + Effets, parfois combinés, de: • début de lactation, L1 • stress thermique,… • fin de lactation, vieille VL (+ traite du soir)
  • 45. • Comptages cellulaires totaux • Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques • Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ? Conclusion 45 Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES Plan – Partie 2
  • 46. Réponse immunitaire “innée” : Réponse immunitaire “adaptative” : • Détection des bactéries • Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires • Phagocytose par : Macrophages Phagocytose par Neutrophiles Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire Bactérie Anticorps Sécrétion accrue d’Ac opsonisants Activation du complément par Ac ¢ épithéliale endommagée Bactérie Toxines, enzymes… Leucocytes “résidents” 4 types principaux de cellules : fonctions • Macrophages : - ¢ sentinelles : initiateurs de la réponse - phagocytes “amateurs” Très fort % si quartiers sains Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques Adapté selon Zaatout et al., 2020 46
  • 47. Réponse immunitaire “innée” : Réponse immunitaire “adaptative” : • Détection des bactéries • Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires • Phagocytose par : Phagocytose par Neutrophiles Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire Bactérie Anticorps Sécrétion d’anticorps Activation du complément ¢ épithéliale endommagée Bactérie Toxines, enzymes… Leucocytes “résidents” • Lymphocytes : - ¢ mémoires - régulation de la réponse bactéricide - production d’Ac - en poste ou en patrouille Fort % si quartiers sains Macrophages Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques • Macrophages : - ¢ sentinelles : initiateurs de la réponse - phagocytes “amateurs” Très fort % si quartiers sains 47
  • 48. Réponse immunitaire “innée” : Réponse immunitaire “adaptative” : • Détection des bactéries • Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires • Phagocytose par : Neutrophiles Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire Bactérie Anticorps ¢ épithéliale endommagée Bactérie Toxines, enzymes… Leucocytes “résidents” Macrophages • Polymorpho- nucléaires Neutrophiles : - Phagocytes professionnels majeurs Très fort % +++ si infection Leucocytes “migrants” (récents) Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques Sécrétion d’anticorps Activation du complément • Lymphocytes : - ¢ mémoires - régulation de la réponse bactéricide - production d’Ac - en poste ou en patrouille Fort % si quartiers sains • Macrophages : - ¢ sentinelles : initiateurs de la réponse - phagocytes “amateurs” Très fort % ++ si quartiers sains 48
  • 49. Réponse immunitaire “innée” : Réponse immunitaire “adaptative” : • Détection des bactéries • Sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires • Phagocytose par : Neutrophiles Lymphocytes attirés par l’environnement inflammatoire Bactérie Anticorps ¢ épithéliale endommagée Bactérie Toxines, enzymes… Macrophages • Cellules épithéliales : - sentinelles IIres - ingestion de bactéries,… ¢ mammaires, constitutives, non inflammatoires (lactifères ou sécrétrices) Très faible % • Neutrophiles : - Phagocytes professionnels majeurs Très fort % +++ si infection Comptages cellulaires différenciés : Bases cytologiques Leucocytes “résidents” Leucocytes “migrants” (récents) Sécrétion d’anticorps Activation du complément • Lymphocytes : - ¢ mémoires - régulation de la réponse bactéricide - production d’Ac - L¢ en poste ou en patrouille Fort % si quartiers sains • Macrophages : - ¢ sentinelles : initiateurs de la réponse - phagocytes “amateurs” Très fort % ++ si quartiers sains
  • 50. • Comptages cellulaires totaux • Comptages cellulaires différenciés : Bases • Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Cytométrie de flux • Microscopie • Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ? Conclusion 50 Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES Plan – Partie 2
  • 51. Plusieurs paramètres analysables pour chaque ¢ Comptages cellulaires différenciés : Techniques Cytométrie de flux = technique d’identification, voire de caractérisation, des cellules (avec quantification) • Marquage cellulaire : > indifférencié : colorants de l’ADN (CCS ou CCD) > différencié : Anticorps monoclonaux couplés à un fluorochrome Des populations Un état de diffé Technologie qui permet d’identifier e manière quantitative et qualitative des po Présence de surface des cel (CD, cluster de Ces marqueurs permettent de distinguer: La cytométrie en flu Marquage spécifique d’antigènes leucocytaires de surface  Différenciation cellulaire fiable et utile  Non disponible en automate haut débit à ce jour (?) (selon informations disponibles)
  • 52. • Diffraction dans l’axe : taille des ¢ • Diffraction latérale : granularité des ¢ Laser Cellule Filtres, miroirs Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Caractérisation cellulaire o Marquage spécifique (1 à 4) o Caractères physiques des ¢ Granularité => différenciation (présomptive) Taille Détecteurs
  • 53. Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Compteur disponible en LIAL pour CCD : Fossomatic® 7 DC DE MACROPHAGES N° 20 s Débris (bruit de fond) Base technique de la différenciation cellulaire utilisée (brevet) Flux cellulaire Granularité Canal de fluorescence 2 Canal de fluorescence 1 Coloration (ADN) : acridine orange Sous-populations cellulaires différenciées Neutrophiles + Lymphocytes Macrophages ¢ somatiques
  • 54. • Comptages (absolus et relatifs %) : o leucocytaire total (sans ¢ épithéliales) o 3 types majeurs différenciés : - lymphocytes - macrophages - neutrophiles • Intérêt d’utiliser des ratios, quelle que soit la méthode : Comptages cellulaires différenciés : Techniques Decoding the immune system for earlier more accurate detection Modeled after the blood leukocyte differential, a test routinely used in humans and companion animals to detect infection, QScout® MLD identifies and differentiates leukocytes (white blood cells) in milk. Each of the three white blood cell types (described below and shown in Figure 1) play a key role in fighting infection, a each has a different function in the immune system. Scout inf ec Figure 1. Fluorescent imaging differentiates cell types Zoetis Microscopie à fluorescence : CCD par quartier Microscopie à fluorescence et reconnaissance d’images o Opposer 2 groupes de variations inverses :  ¢ résidentes, pré-inflammatoires : Macrophages, Lymphocytes  ¢ inflammatoires survenant massivement lors de mammite : Neutrophiles o Ratio Neutrophiles / Lympho¢ (bien corrélé à bactériologie), ou Neutrophiles / Macrophages - de laboratoire - portative (Gonçalves et al., 2017)
  • 55. • Comptages cellulaires totaux • Comptages cellulaires différenciés : Bases • Comptages cellulaires différenciés : Techniques • Comptages cellulaires différenciés : Intérêts et limites ? • Facteurs non infectieux de variation • Facteurs infectieux de variation • Performances diagnostiques connues Conclusion 55 Apports des COMPTAGES CELLULAIRES DIFFERENCIES Plan – Partie 2
  • 56. CCD : Facteurs non infectieux de variation Stade et rang de lactation principalement Etude Italie 2020 : • Technique : Foss® 7DC • Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses • Durée : 23 mois (CL) Zecconi et al., 2020 % L¢ + Neutrophiles en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS Stade de L. : élévations (p<0,001) - en début de L. - fin : VL âgées Ex des L3 : ∆ 10% entre début et fin < 50 000 cell/ml :  L¢ ++, PMNN - ?
  • 57. CCD : Facteurs non infectieux de variation Etude Italie 2020 (CL) : • Technique : Foss® 7DC • Effectifs : 12 élevages, 18000 analyses • Durée : 23 mois % L¢ + Neutrophiles pour des CCS en fonction du stade et du rang de L., selon les CCS Interactions stade x rang de L. et stade x CCS Rang de L. : (p<0,001) - à CCS égaux et faibles, et stade de L. fixé, % + élevés chez L1 surtout, puis L ≥ 4 - L1 : CCS les + faibles et CCD les + élevés Stade et rang de lactation principalement  Cellularité particulière des L1
  • 58. CCD : Facteurs infectieux de variation Sous-populations cellulaires en fonction des CCS Damm et al., 2017 • Autres : pentes + fortes - Macrophages : décroissance - Neutrophiles : augmentation Microscopie à fluorescence (comme référence par rapport au 7 DC) 1ère étude sur Foss® 7 DC : • Technique : microscopie • N=293 laits • Etude non indépendante • A confirmer (dans diverses situations physiologiques, bactériologiques,…) • Lymphocytes (%) : avec l’augmentation des CCS, décroissance : - de pente faible - entre 20 et 1%
  • 59. CCD : Facteurs infectieux de variation Sous-populations cellulaires en fonction des types de bactéries pathogènes Kirkeby et al., 2019 • La dispersion des % dans l’intervalle log 4-6 paraît assez proche entre : - “No pathogens” : 32-81% - “PMajeur” : 33-88% - “pmineur” : 33-84% • A préciser Etude Danemark 2019 : • Technique : Foss® 7DC • Effectifs : 2 élevages, 3800 analyses • Durée : 1 an (CL) • Etude non indépendante
  • 60. Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur prédictive positive Valeur prédictive négative CCD : Performances diagnostiques ? Performances des CCS et de l’association CCS + CCD Etude Québec 2020 : • Technique : Foss® 7DC • Effectifs * : 11 élevages, 4 CL successifs (1107 CL) bactériologie : composite • Bactériologie (1 seule) : - négatif : 17% - PM ** : 13% - pm : 62% • Etude non indépendante • CCS seuls (Schwarz et al., 2020) Pas d’étude indépendante (avec même technique). Peu d’études comparatives de qualité. Choix de l’étude québécoise récente comme exemple car : - assez large * ; conditions du terrain (données de CL) - mais ne présentant que les résultats relatifs aux PM ** (fréquent) Bon compromis (si seuil par défaut) Mauvaise sensibilité Mauvaise à médiocre Très bonne Invariables Dépendant de la prévalence
  • 61. CCD : Performances diagnostiques ? Comptage Seuil(s) Sensibilité Spécificité Valeur prédictive positive Valeur prédictive négative encore + mauvaise à médiocre très Très bonne Sensibilité améliorée Spécificité détériorée * 26 à 36% des mamelles bactério – présentent un % Neutrophiles + L¢ élevé * Performances en englobant les pathogènes mineurs ? • Association CCS + CCD 61
  • 62. Bilan, conclusion 62 • Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion o Performances bien connues  Paramètre historique, « indétrônable » (paiement du lait)…, mais assez peu adapté à 1 discrimination précise des mamelles selon leur statut infectieux, car au moins 3 limites significatives :  Donc à utiliser en connaissant ses limites : - ≠ outil de Diagnostic (certitude) - mais = Dépistage de masse (de 1ère intention) Faux-positifs Facteurs de variation non infectieux Faux-négatifs “Pulsatilité” des CCS – pathogènes mineurs
  • 63. Bilan, conclusion 63 o Périodes-clefs : antibiothérapie HL ciblée (nouveau Règlement UE 2022)  S’appuyer sur la VPN, en valorisant plusieurs CCS : 85% à 96% (fonction des études)  obturateurs de trayons  Reste du troupeau = quelques rares “douteuses” + infectées  ABthérapie HL à visée curative, avec spécialités à persistance moyenne  Plus généralement (HL et en lactation) : associer plusieurs analyses, décalées dans le temps (fluctuations), et si possible de nature différente :  évaluations cellulaires fréquentes (robots)  conductivité par quartier (en ligne) à interpréter en relatif  bactériologie (simplifiée, mais optimisée)  CCD,… • Comptages cellulaires totaux (indifférenciés) : Conclusion
  • 64. • Comptages cellulaires différenciés : Bilan d’étape o Principe très intéressant dans le “paysage diagnostique” actuel, encore assez pauvre, mais en évolution o Déclinaison commerciale disponible :  Intérêt +++ : haut débit  Physiologiquement : par rapport aux CCS, 2 à 3 difficultés persistent : F. de V. non infectieux, “pulsatilité” (pm ?)  Techniquement : différenciation cellulaire partielle (2 groupes)  Etudes complémentaires nécessaires (labo + élevages) : - F. de variation à préciser : liés aux VL, bactéries et élevages (seuils à adapter) - études longitudinales o Utilisation 1 : dépistage optimisé par l’amélioration de la sensibilité (70% à 88%)  Faux + donc bactériologie simple de confirmation (cas les + douteux) o Utilisation 2 : évaluation de l’efficacité des traitements (Ecoantibio) : + précise, + rapide ? o Utilisation 3 (moyen terme) : phénotype possible pour sélection génétique Bilan, conclusion