Cromatografia: Fundamentos e aplicações

CROMATOGRAFIA:
Fundamentos e
aplicações
Eng. Bruno Cortez
Depto. de Engenharia Química
Escola de Engenharia de Lorena – EEL/USP

DEFINIÇÃO
 Conjunto de técnicas de separação cujo
princípio depende da distribuição
diferenciada dos componentes de uma
mistura entre duas fases, uma considerada
estacionária, e a outra, móvel.
KROMA + GRAPH
(COR) (ESCREVER)

DEFINIÇÃO
 Diferenças nas propriedades das fases móvel
e estacionária possibilitam com que os
componentes da amostra se desloquem
através do material cromatográfico com
velocidades desiguais, gerando a separação

ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
 AFINIDADE ⇒ SEPARAÇÃO

LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
LÍQUIDA GÁS FLUÍDO
SUPERCRÍTICO
Líquida (CP)
Sólida (CCD)
Ligada (CCD)
Ligada (CSFL)Sólido (CSS)
Líquida (CGL)
Sólida (CGS)
Ligada (CGFL) Líquida (CLL)
Sólida (CLS, CE)
Ligada (CFLF, CTI e CB)

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
SIGLA NOME TIPO DE SEPARAÇÃO
CP Papel Partilha
CCD Camada Delgada Partilha
CCD-FL Camada Delgada com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção
CGL Gás-Líquido Distribuição
CGS Gás-Sólido Adsorção
CGFL Gasosa com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CSS Sólida com Fase Móvel Super-crítica Adsorção
CSFL CSS com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CLL Líquido-Líquido Partilha
CLS Líquido-Sólido Adsorção
CE Exclusão Permeação
CLFL Líquida com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção
CTI Troca Iônica Interações Polares
CB Bioafinidade Bioatividade

TIPOS DE SEPARAÇÃO
 Os princípios físico-químico básicos de separação são:
 Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase estacionária
através de interações químicas ou físicas.
 Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve a
superfície do suporte sólido.
 Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo
funcional) da fase estacionária.
 Exclusão moléculas: As moléculas são separadas por
tamanho, havendo retenção das maiores.
 Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e
reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária.

Cromatografia Gasosa (CG)
 Técnica de separação, em que substâncias
capazes de se volatilizarem, percolam em
uma corrente de gás através da fase
estacionária.
 Dependendo da natureza da fase
estacionária, a cromatografia gasosa pode
ser dividida em 2 grupos:
 Cromatografia gás-líquido (GLC)
 Cromatografia gás-sólido (GSC)

 O QUE ANALISAR?
 Compostos voláteis de pontos de ebulição de
até 350 ºC e pesos moleculares menores que
500
 Compostos que possam produzir derivados
voláteis
 Compostos termicamente estáveis na
condições de trabalho

 ALGUMAS
APLICAÇÕES
 Indústria Petroquímica
 Alimentos e Bebidas
 Biocidas
 Medicamentos
 Meio ambiente

 DESCRIÇÃO DE UM CROMATÓGRAFO:
 Cilíndro contendo gás carreador (hidrogênio,
hélio, argônio ou nitrogênio), com fluxo controlado
e regulador de pressão
 Sistema de injeção de amostra
 Coluna cromatográfica
 Detectores
 Condutividade térmica
 Ionização de chama
 Registrador

 GÁS DE ARRASTE
 FASE MÓVEL EM CG: NÃO interage com a amostra –
apenas a carrega através da coluna. Assim é
usualmente referida como gás de arraste
 INERTE: Não deve reagir com a amostra, fase
estacionária ou superfícies do instrumento
 PURO: Deve ser isento de impurezas que possam
degradar a fase estacionária

 Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
 H2O, O2 ⇒ oxida/hidrolisa
algumas FE, incompatíveis
com DCE
 Hidrocarbonetos ⇒
ruído no sinal de DIC

GASES - FILTROS

 CUSTO: Gases de
altíssima pureza
podem ser muito
caros

 COMPATÍVEL COM UM DETECTOR:
 Cada detector demanda um gás de arraste
específico para melhor funcionamento

 Alimentação do gás
de arraste

 Dispositivos de Injeção de Amostra
 Os dispositivos para injeção (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de
introdução INSTANTÂNEA da amostra na
coluna cromatográfica

 SISTEMAS DE INJEÇÃO

INJETOR “ON-COLUMN” CONVENCIONAL

 Injeção “on-column” de líquidos

 INJETORES SPLIT/SPLITLESS

 SPLIT
 Amostras concentradas onde a diluição com solvente
é impossível particularmente devido a co-eluição
 SPLITLESS
 Amostras diluídas ou análise de traços
 Análise em ampla faixa de ponto de ebulição e
polaridade
 Adequado para análide de amostras complexas
(multicomponentes)

 Parâmetros de Injeção
 TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser
suficientemente elevada para que a amostra vaporize-
se imediatamente, mas sem decomposição
 REGRA GERAL: Tinj=50 ºC acima da temperatura de
ebulição do componente menos volátil
 VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do
estado físico da amostra
Sólidos: convencionalmente
se dissolve em um solvente
adequado e injeta-se a
solução

 MICROSSERINGAS PARA INJEÇÃO
 LÍQUIDOS: capacidades típicas ⇒ 1μL, 5 μL e 10 μL

 COLUNAS
CROMATOGRÁFICAS
Colunas empacotadas

 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
 Coluna Empacotada
 VANTAGENS
 Simples preparação e uso
 Tecnologia clássica
 Grande número de fases líquidas
 Capacidade alta e longa durabilidade
 Usada para análise de gases com DCT
 DESVANTAGENS
 Número de pratos limitado
 Exige controle da vazão da fase móvel
 Análises relativamente demoradas
 Baixa resolução para amostras complexas

 Temperatura da Coluna
 Além da interação da FE, o tempo que um
analito demora para percorrer a coluna
depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0
)

 Temperatura da Coluna
 CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG

 FORNO DA COLUNA
 Características desejáveis de um forno:
 Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos
de Tamb até 400 ºC. Sistemas criogênicos (T < Tamb)
podem ser necessários em casos especiais
 Temperatura independente dos demais módulos:
Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e
detector
 Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas
de ventilação interna muito eficientes para manter
a temperatura homogênea em todo forno

 FORNO DA COLUNA
 Características desejáveis de um forno:
 Fácil acesso à coluna: A operação de troca de
coluna pode ser freqüente
 Aquecimento e resfriamento rápido: Importante
tanto em análises de rotina e durante o
desenvolvimento de metodologias analíticas
novas
 Temperatura estável e reprodutível: A temperatura
deve ser mantida com precisão e exatidão de ± 0,1
ºC
EM CROMATÓGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980)
O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO É
TOTALMENTE OPERADO POR
MICROCOMPUTADORES

 Programação Linear de Temperatura
 Misturas complexas (constituintes com
volatilidades muito diferentes) separadas
ISOTERMICAMENTE:

 A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separação:

POSSÍVEIS PROBLEMAS
ASSOCIADOS À PLT

 DETECTORES: Dispositivos que examinam
continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o
gás de arraste

 DETECTORES MAIS IMPORTANTES:
 Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD):
Variação da condutividade térmica do gás de arraste
 Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID): Íons
gerados durante a queima dos eluatos em uma chama
de H2 + ar
 Detector por Captura de Elétrons (DCE ou ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de
elétrons por eluatos altamente eletrofílicos

 FASES ESTACIONÁRIAS

 Características de uma FE ideal
 SELETIVA: Deve interagir diferencialmente
com os componentes da amostra
REGRA GERAL: A FE deve ter
características tanto quanto
possível próximas das dos
solutos a serem separados
(polar, apolar, aromático...)

 Características de uma FE ideal
 AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO: Maior
flexibilidade na otimização da separação
 BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA: Maior
durabilidade da coluna, não reage com componentes
da amostra
 POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes
(menor resistência à transferência do analito entre
fases)
 DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA:
Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma”
nos cromatogramas

 FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO
 O fenômeno físico-químico responsável pela interação
do analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

 FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO

 FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS
 Características Gerais:
 Sólidos finamente granulados (diâmetros de
partículas típicos de 105 µm a 420 µm)
 Grandes áreas superficiais (até 102
m2
/g)

 FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS:
ABSORÇÃO
 O fenômeno físico-químico responsável pela interação
do analito + FE sólida é a ABSORÇÃO
A ABSORÇÃO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LÍQUIDA
(FENÔMENO INTRAFACIAL)

 FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS:
ABSORÇÃO

 FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS

 QUIRAIS

 COLUNAS EMPACOTADAS
 Tubo de material inerte recheado com FE sólida
granulada ou FE líquida depositada sobre um suporte
sólido

 COLUNAS EMPACOTADAS
 FE Líquidas: SUPORTE

 COLUNAS CAPILARES

 COLUNAS CAPILARES
 DIÂMETRO INTERNO

 APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA GASOSA NA
CARACTERIZAÇÃO DE POLÍMEROS
 Os polímeros possuem peso molecular muito alto e, portanto,
pressão de vapor muito baixa. Eles não podem ser analisados
diretamente pela CG
 Determinação de pureza de monômeros, solventes e aditivos.
 Análise de componentes voláteis nos polímeros, tais como
monômero residual, plastificantes, antioxidantes e solventes
residuais em adesivos e tintas.
 Acompanhamento da cinética de reação de polimerização.
 Pirólise do polímero e caracterização de sua estrutura
 Análise do polímero como fase estacionária –
CROMATOGRAFIA GASOSA INVERSA

Cromatografia de Exclusão por
Tamanho (SEC)
 Método popular para separação e análise de
materiais poliméricos
 Determinação simultânea
 Peso molecular numérico médio
 Peso molecular ponderal médio
 Distribuição do peso molecular
 Conhecida popularmente por
CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM
GEL (GPC)

Tamanho (SEC)
 MECANISMO DA SEPARAÇÃO
O recheio das colunas é
constituído de partículas
contendo poros de diver-
sos tamanhos.
O volume total da fase
móvel corresponde ao
volume de poros (Vp),
mais o volume intersticial
(Vo), também conhecido
por volume morto

Tamanho (SEC)
MOLÉCULAS MAIORES: não são
retidas pelos poros.
Logo, são ELUÍDAS primeiro.
MOLÉCULAS MENORES: são
capazes de permear totalmente
no recheio.
Logo, são ELUÍDAS por último.

Tamanho (SEC)
 VOLUME DE ELUIÇÃO:
 Ve = Vo + KVp
 Onde: Ve é o volume de eluição; Vo é o volume
intersticial; K é o coeficiente de distribuição do soluto;
Vp é o volume dos poros.
 O valor de K situa-se na faixa entre 0 e 1.
 K=0.....o soluto é totalmente excluído dos poros
 K=1.....o soluto é totalmente permeado nos poros
 0<K<1 faixa de separação

Tamanho (SEC)

Tamanho (SEC)
 Exemplo:
 Coluna de separação para SEC, do tipo
ultrastyragel®, fabricada pela Waters Inc. contém
aproximadamente 6 mL de solvente dentro dos
poros (volume dos poros) e 6 mL de solvente nos
interstícios entre as partículas que compõem o
recheio.

Tamanho (SEC)
 Conclusão:
 Nenhuma molécula poderá eluir antes de 6 mL ou
depois de 12 mL. Moléculas de tamanho
intermediário eluirão a um volume entre 6 e 12 mL.

Tamanho (SEC)
 TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIA PARA SEC
 O tamanho dos poros deve ser comparável ao tamano da
macromolécula a ser analisada.
 A distribuição de tamanho de poros deve ser de tal forma
que forneça uma dependência linear do volume de eluição
com o logaritmo do tamanho molecular dos polímeros
investigados.
 A fase estacionária não deve exibir qualquer interação, do
tipo adsorção, com a substância a ser analisada.
 A fase estacionária deve possuir resistência mecânica e
estabilidade térmica e química.

Tamanho (SEC)
 TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIA PARA
SEC
 Polímero macroporoso
 Possuem estrutura tri-dimensional, e são preparados
por copolimeração ou reticulação de macromoléculas.
 Podem ser semi-rígidos ou do tipo soft-gel
 Silicato macroporoso
 São rígidos e não incham na presença de solventes.
 Tamanho dos poros não são influenciados pela
temperatura ou pelo solvente.

Tamanho (SEC)
 SELEÇÃO DA COLUNA
 Colunas disponíveis com vários tamanhos de
poros
 A escolha depende do tamanho das
macromoléculas do soluto a serem analisadas
 Pode-se usar várias colunas dispostas em séries
e com tamanhos de poros variados, OU uma
coluna com gradiente de porosidade ao longo de
seu comprimento

Tamanho (SEC)
 CURVAS DE CALIBRAÇÃO
 Não é um método absoluto...REQUER a
construção de uma curva de calibração para
converter os dados fornecidos pelo instrumento
em valores de massa molar e sua distribuição.
 A partir dos valores de Vr de amostras
monodispersas de massa molar conhecida
(PADRÕES), é possível determinar a massa
molar de amostras desconhecidas

Tamanho (SEC)
 Exemplo:
 Curva construída
usando-se padrões de
poliestireno de massa
molar conhecida e de
distribuição estreita,
praticamente
monodispersos
 A injeção de cada
padrão fornece uma
curva, cujo pico é
considerado o volume de
eluição, Vr

Tamanho (SEC)
 Os valores de Vr, colocados em gráfico
contra a massa molar dos padrões, fornecem
a curva de calibração.

Tamanho (SEC)
 A curva de calibração assim construída
corresponde ao poliestireno analisado
naquelas condições específicas de solvente
e tamanho dos poros.
 Poderá ser usada para outros polímeros???
 Devido à especificidade dessas condições, a
aplicação direta da curva de calibração
exemplificada, a polímeros de estrutura diferente
poderá levar a resultados fictícios.

Tamanho (SEC)
 CURVA DE CALIBRAÇÃO UNIVERSAL
 Baseada no volume hidrodinâmico
 Na verdade os polímeros são eluídos em função de seu
volume hidrodinâmico, e não de sua massa
 VOLUME HIDRODINÂMICO PODE SER EXPRESSO EM
TERMOS DO PRODUTO DA MASSA MOLECULAR [M] E A
VISCOSIDADE INTRÍSECA [n] DA AMOSTRA DO POLÍMERO
 Dois polímeros diferentes que aparecem no mesmo volume
de eluição, no mesmo solvente, e nas mesmas condições
instrumentais terão o mesmo volume hidrodinâmico e as
mesmas características de [n]M

Tamanho (SEC)
 CURVA DE CALIBRAÇÃO UNIVERSAL

Tamanho (SEC)
 FASE MÓVEL
 TOLUENO
 não absorve água e não degrada com facilidade.
 Não pode ser utilizado quando o sistema de detectores é constituído por
detectores UV.
 TETRAHIDROFURANO
 Pode ser utilizado com detectores UV e de índice de refração.
 Absorve água com muita facilidade.
 Utilizar o solvente recém-destilado e adição de estabilizante para peróxidos.
 CLOROFÓRMIO
 Não absorve água com tanta facilidade e pode ser usado com detector UV
 Com o tempo pode ocorrer decomposição, com liberação de ácido clorídrico,
extremamente prejudicial às colunas.
 ÁGUA
 Análise de polímeros hidrossolúveis.

Tamanho (SEC)
 APLICAÇÕES
 Caracterização de materiais poliméricos
 Determinação dos pesos moleculares numérico e
ponderal médios, e distribuição do peso
molecular.

Tamanho (SEC)
 EFEITO DA DISTRIBUIÇÃO DO PESO
MOLECULAR NAS PROPRIEDADES MECÂNICAS

Tamanho (SEC)
 EFEITO DAS CONDIÇÕES DE
PROCESSAMENTO NA DEGRADAÇÃO DE
UM POLÍMERO

Tamanho (SEC)
 CONTROLE DE QUALIDADE
(a) Cromatograma de uma
amostra de PVC contendo
plastificante.
(b) Cromatograma de uma
mistura de plastificantes
comuns
1 – ftalato de dioctila
2 – ftalato de dibutila
3 – ftalato de dietila
4 – ftalato de dimetila

Tamanho (SEC)
 ACOMPANHAMENTO DE REAÇÃO

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