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Cromatografia Liquida – CLAECromatografia Liquida – CLAE
professora ; adrianne mendonçaprofessora ; adrianne mendonça
O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação
na qual os component...
O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a Líquido
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Definição:
Na técnica de cromatografia a líquid...
Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
CLAE -HPLCCLAE -HPLC
Fase móvel
(amostra)
Fase estacionária
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Anal...
INSTRUMENTAÇÃO
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One pump used to
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Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
PURGAINJETOR
COLUNA
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BOMBA
DETECTOR
Componentes de umComponentes de um
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Componentes auxiliares deComponentes auxiliares de
um HPLCum HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o
fluxo ...
BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre...
Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de um
HPLCHPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca r...
Fase estacionáriaFase estacionária
Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
 Sílica- C8
 Sílica- C18
 Sílica- C18 ( ODS)
 Síl...
SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica
- Variedade de forma, tamanho de partículas e
poros
- Instabilidade frent...
Si
OH
Si
HO OH
Si
OH
Si
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SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase EstacionáriaFase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada
é composta de partículas
microporosas de sílica.
S...
MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
Fases Quimicamente Ligadas
C18 (ODS)
forte
C8
amostra
amostra
amostra
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média
fraca
POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de c...
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quan...
RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ
INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS
POLÍMEROS ORGÂN...
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos
funcionais nas ca...
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
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Fases estacionárias Interações
C8
PH
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van der Waals
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Eletrostática
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Processo de EluiçãoProcesso de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na
fase estacionária.
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Força eluente:
 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
 Utiliza uma fase estacio...
DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
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Detectam apenas substâncias...
DETECTORES
UV
FLUORESCÊNCIA
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ELETROQUÍMICO
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POLARÍMETRO
É mais comum, usado na
CLAE.
 Porque muitos solutos
absorvem a luz ultravioleta.
 São bons para a eluição
por gradiente...
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela
amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (m...
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um
soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluores...
Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da
fase móvel e do eluente vindo da coluna
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- Sensível a ...
Princípio: Determinação da massa de solutos através da
ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
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MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃO
NORMAL
REVERSO
TROCA IÔNICA
MODO NORMAL
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Fase móvel: mistura de solventes ...
MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase m...
Tempo de Retenção e
Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS)
forte
Interação
fraca
HidrofobicidadeHidrofobicidade
 Se a amostra possui
 CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica
 : grupo aromático
 Se a amostra ...
TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / an...
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: S...
SeqüênciaSeqüência
Lavagem da coluna -MeOH por
30 minutos
Condicionamento da coluna com
fase móvel
Monitoramento da lin...
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
NÚMERO DE PRATOS (N)
Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SINAL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
t...
A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento exce...
w
2 na linha de base
BANDA CROMATOGRÁFICA
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k...
t
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Se:
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
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k1 = 1,3
k2 = 1,8
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
α
k2
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AVALIA A SELETIVIDADE
Se:
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α = 1,38
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α
k2
=
k1
α = 1 não houve separação
NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistema
Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
tr
N= 5,54
w0,5
2
ResoluçãoResolução
é função da
Seletividade (α)
Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)
ResoluçãoResolução
Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borb...
MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da
corrida; a composição ds FM é...
Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico
a
b
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d
a
b
c
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[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
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1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO
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FiltraçãoFiltração
É necessária, previamente à injeção,
usualmente com membranas de 0.45 µm
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DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado
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ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
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PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que
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APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
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APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
ReferênciasReferências
 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;
VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice...
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  12. 12. Fase estacionáriaFase estacionária
  13. 13. Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas Fases estacionárias :  Sílica- C8  Sílica- C18  Sílica- C18 ( ODS)  Sílica- NH2  Sílica- Diol  Sílica  Troca Iônica  Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca  Resinas DVB-ST porosas Pré-Coluna:  É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .  Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
  14. 14. SÍLICA (suporte + usado): - Resistência mecânica - Variedade de forma, tamanho de partículas e poros - Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
  15. 15. Si OH Si HO OH Si OH Si OH SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS LIVRES GEMINAL VICINAIS influenciam no grau de acidez da sílica
  16. 16. Fase EstacionáriaFase Estacionária A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
  17. 17. MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL - QUIMICAMENTE LIGADAS - HÍBRIDAS - RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
  18. 18. Fases Quimicamente Ligadas C18 (ODS) forte C8 amostra amostra amostra C4 média fraca
  19. 19. POLIMÉRICAS Pré-hidrólise do agente silanizante - Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
  20. 20. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS Matriz orgânica-inorgânica - Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais - Menor quantidade de grupos de silanóis - Ultra-fast cromatografia Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano (RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
  21. 21. RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS -RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA - SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS
  22. 22. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte - Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) • Poli(etileno) • Poli(butadieno) • Poli(estireno) • Poli(dimetilsiloxano) • Poli(metiloctilsiloxano) • Poli(metiloctadecilsiloxano) • Poliéteres • Polissacarídeos • Poliaminas • Polinucleotídeos • Poliamidas • Proteínas Sílica Zircônia Titânia Alumina
  23. 23. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO) INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
  24. 24. Fases estacionárias Interações C8 PH C2 van der Waals van der Waals van der Waals Si Si Si
  25. 25. Fases estacionárias Interações CN NH2 2OH Dipolo/Dipolo O H Si N H H OSi O H OO H H Si N O H C Ligação de hidrogênio Ligação de hidrogênio Fase Estacionária
  26. 26. PRS CBA SAX Eletrostática Eletrostática Eletrostática H3 +N SO3 -Si Si H3 +N O- O N+(CH3)3Si -O3S Fases estacionárias Interações Fase Estacionária
  27. 27. Processo de EluiçãoProcesso de Eluição Definição: Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária. Série eluotrópica  Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
  28. 28. Força eluente:  É uma medida da energia de adsorção do solvente Cromatografia com fase normal:  Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar. Cromatografia com fase reversa:  Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.
  29. 29. DETECTORES - Classificação UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
  30. 30. DETECTORES UV FLUORESCÊNCIA MS ELETROQUÍMICO IR POLARÍMETRO
  31. 31. É mais comum, usado na CLAE.  Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.  São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes. DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:
  32. 32. Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. - Seletivo (moléculas com cromóforos) - Comprimento de onda (λ) fixo - λ pode ser selecionado (190 – 600 nm) - Varredura (DAD) - Solventes também absorvem Ultra violeta (UV-visível): Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF 190 210 200 330 200 245 215 λ nmSolvente
  33. 33. Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV - Seletivo (moléculas que fluorescem) - Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas - Mais sensível que UV por ser emissão - Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente. - Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila Fluorescência:
  34. 34. Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
  35. 35. Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna - Não- seletivo - Sensível a variações de: - Temperatura - Pressão - Fluxo - Composição fase móvel - Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar - Muito usado em cromatografia preparativa Indice de refração:
  36. 36. Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z) - Destrutivo - Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS) - Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI - Análise de micro e macromoléculas. - Alta sensibilidade Espectrometria de massas:
  37. 37. MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃO NORMAL REVERSO TROCA IÔNICA
  38. 38. MODO NORMAL MECANISMO DE INTERAÇÃO: ADSORÇÃO Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel Fase móvel: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
  39. 39. MODO REVERSO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA HIDROFOBICIDADE Fase estacionária: APOLAR Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
  40. 40. Tempo de Retenção e Hidrofobicidade OH OH C18 (ODS) forte Interação fraca
  41. 41. HidrofobicidadeHidrofobicidade  Se a amostra possui  CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica  : grupo aromático  Se a amostra possui  -COOH : grupo carboxílico  -NH2 : grupo amino  -OH : grupo hidróxi A hidrofobicidade será forte A hidrofobicidade será fraca
  42. 42. TROCA IÔNICA MECANISMO DE INTERAÇÃO : ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
  43. 43. Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Obs: Seringa de HPLC
  44. 44. SeqüênciaSeqüência Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras
  45. 45. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS FATOR DE RETENÇÃO (k) FATOR DE SEPARAÇÃO (α) NÚMERO DE PRATOS (N)
  46. 46. Cromatograma tR tM TEMPO SINAL tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
  47. 47. A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
  48. 48. w 2 na linha de base BANDA CROMATOGRÁFICA
  49. 49. Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases Não leva em conta o tempo morto da coluna FATOR DE RETENÇÃO (k) tr – to k = to tr = tempo retenção analito to = tempo morto da coluna
  50. 50. t r o o k = t t Se: t0 = 1,5 min t1 = 3,5 min t2 = 4,2 min k1 = 1,3 k2 = 1,8
  51. 51. FATOR DE SEPARAÇÃO (α) α k2 = k1 AVALIA A SELETIVIDADE
  52. 52. Se: k1 = 1,3 k2 = 1,8 α = 1,38 k1 = 1,3 k2 = 1,8 α k2 = k1 α = 1 não houve separação
  53. 53. NÚMERO DE PRATOS (N) Mede a eficiência do sistema Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel tr N= 5,54 w0,5 2
  54. 54. ResoluçãoResolução é função da Seletividade (α) Eficiência da coluna (N) Fator de retenção (k)
  55. 55. ResoluçãoResolução Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
  56. 56. FASE MÓVEL - Solvente grau HPLC (alta pureza) - Filtração (membrana 0.45 μm) - Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático) - Purgar os solventes
  57. 57. MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO: Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE. GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida. - Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
  58. 58. Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico a b c d a b c d [ MeOH/H2O ] par crítico : c,d [ THF/H2O ] par crítico : a,b a b c d [ MeOH/THF/H2O ]
  59. 59. 1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..) 2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE) 3) EXTRAÇÃO: - LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE) PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
  60. 60. FiltraçãoFiltração É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 µm mesh para a remoção do material insolúvel.
  61. 61. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito
  62. 62. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector Cálculo de área:
  63. 63. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA Se ambos os compostos respondessem igualmente ao detector poderíamos usar a relação: Massa A Área A Massa B Área B No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
  64. 64. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão. Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:
  65. 65. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra. É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
  66. 66. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração. Mx = massa do componente x Ma = massa da amostra Mp = massa do padrão Ap = área do padrão Ax = área corrigida do componente x
  67. 67. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.
  68. 68. APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
  69. 69. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
  70. 70. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
  71. 71. ReferênciasReferências  TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.  AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6
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