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Cromatografia Liquida – CLAECromatografia Liquida – CLAE
professora ; adrianne mendonçaprofessora ; adrianne mendonça
O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação
na qual os componentes a serem separados
de uma mistura migram entre duas fases
sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes
da mistura definem o grau de afinidade entre
as duas fases, acontecendo o fenômeno de
migração diferencial .
O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a Líquido
HPLC?HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a
fase móvel é um líquido e a fase
estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na
fase líquida , sendo que os componentes da
amostras devem estar dissolvidos.
Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
CLAE -HPLCCLAE -HPLC
Fase móvel
(amostra)
Fase estacionária
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de
partição
Cromatografia liquida
INSTRUMENTAÇÃO
pump
injector
column
oven
detector
One pump used to
control 4 reservoirs;
mixing is done
before pump.
MIXER
data
processor
Fase móvel
Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
PURGAINJETOR
COLUNA
FM
BOMBA
DETECTOR
Componentes de umComponentes de um
Cromatógrafo a Líquido HPLCCromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes
principais :
 Injetor :
É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ;
 Coluna cromatografia :
É o dispositivo que tem a função de separar os
componentes da amostra ;
 Detector :
É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas
Componentes auxiliares deComponentes auxiliares de
um HPLCum HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o
fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a
um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão.
BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
Cromatografia liquida
Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de um
HPLCHPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca rápida de
solvente desviando o fluxo de solvente para o
dreno.
Misturador:
É o dispositivo que homogeneíza a mistura de
solventes quando operando com gradiente de
eluição .
Fase estacionáriaFase estacionária
Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
 Sílica- C8
 Sílica- C18
 Sílica- C18 ( ODS)
 Sílica- NH2
 Sílica- Diol
 Sílica
 Troca Iônica
 Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
 Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
 É o uma pequena coluna instalada a montante
da coluna analítica .
 Tem como objetivo reter sólidos e em muitos
casos reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica
- Variedade de forma, tamanho de partículas e
poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou
básicas
- Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Si
OH
Si
HO OH
Si
OH
Si
OH
SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase EstacionáriaFase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada
é composta de partículas
microporosas de sílica.
São permeáveis ao solvente e
possuem uma área superficial de
varias centenas de metros por
gramas.
Não deve ser utilizada em
sistemas com pH acima de 8,0.
MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
Fases Quimicamente Ligadas
C18 (ODS)
forte
C8
amostra
amostra
amostra
C4
média
fraca
POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quantidade de grupos de silanóis
- Ultra-fast cromatografia
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ
INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS
POLÍMEROS ORGÂNICOS
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos
funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos
filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
• Poli(etileno)
• Poli(butadieno)
• Poli(estireno)
• Poli(dimetilsiloxano)
• Poli(metiloctilsiloxano)
• Poli(metiloctadecilsiloxano)
• Poliéteres
• Polissacarídeos
• Poliaminas
• Polinucleotídeos
• Poliamidas
• Proteínas
Sílica
Zircônia
Titânia
Alumina
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fases estacionárias Interações
C8
PH
C2
van der Waals
van der Waals
van der Waals
Si
Si
Si
Fases estacionárias Interações
CN
NH2
2OH
Dipolo/Dipolo
O
H
Si N
H
H
OSi
O
H
OO
H
H
Si
N
O
H
C
Ligação de
hidrogênio
Ligação de
hidrogênio
Fase Estacionária
PRS
CBA
SAX
Eletrostática
Eletrostática
Eletrostática
H3
+N
SO3
-Si
Si
H3
+N
O-
O
N+(CH3)3Si
-O3S
Fases estacionárias Interações
Fase Estacionária
Processo de EluiçãoProcesso de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na
fase estacionária.
Série eluotrópica
 Ordena os solventes de acordo com suas habilidades
relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
Força eluente:
 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
 Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente
menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
 Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente
polar e um solvente polar.
DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade
eluída de um analito
DETECTORES
UV
FLUORESCÊNCIA
MS
ELETROQUÍMICO
IR
POLARÍMETRO
É mais comum, usado na
CLAE.
 Porque muitos solutos
absorvem a luz ultravioleta.
 São bons para a eluição
por gradiente com
solventes não-absorventes.
DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela
amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):
Água
MeOH
ACN
Acetona
Hexano
Clorofórmio
THF
190
210
200
330
200
245
215
λ nmSolvente
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um
soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para
que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de
dansila
Fluorescência:
Cromatografia liquida
Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da
fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:
- Temperatura
- Pressão
- Fluxo
- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da
ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:
Cromatografia liquida
MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃO
NORMAL
REVERSO
TROCA IÔNICA
MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
MODO REVERSO
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SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
Tempo de Retenção e
Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS)
forte
Interação
fraca
HidrofobicidadeHidrofobicidade
 Se a amostra possui
 CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica
 : grupo aromático
 Se a amostra possui
 -COOH : grupo carboxílico
 -NH2 : grupo amino
 -OH : grupo hidróxi
A
hidrofobicidade
será forte
A
hidrofobicidade
será fraca
TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: Seringa de HPLC
SeqüênciaSeqüência
Lavagem da coluna -MeOH por
30 minutos
Condicionamento da coluna com
fase móvel
Monitoramento da linha de base
Injeção das amostras
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
NÚMERO DE PRATOS (N)
Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SINAL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
w
2 na linha de base
BANDA CROMATOGRÁFICA
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – to
k =
to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
t
r o
o
k =
t t
Se:
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
α
k2
=
k1
AVALIA A SELETIVIDADE
Se:
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α = 1,38
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α
k2
=
k1
α = 1 não houve separação
NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistema
Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
tr
N= 5,54
w0,5
2
ResoluçãoResolução
é função da
Seletividade (α)
Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)
ResoluçãoResolução
Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
Cromatografia liquida
FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento
de He ou automático)
- Purgar os solventes
MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da
corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
GRADIENTE:
- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo
da corrida.
- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico
a
b
c
d
a
b
c
d
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
a
b
c
d
[ MeOH/THF/H2O ]
1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO
- LÍQUIDO-SÓLIDO
- SOXHLET
- FLUÍDO SUPER CRÍTICO
- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
FiltraçãoFiltração
É necessária, previamente à injeção,
usualmente com membranas de 0.45 µm
mesh para a remoção do material insolúvel.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado
de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma
solução padrão do
analito suspeito
ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
A área do pico é proporcional a massa que
passa pelo detector
Cálculo de área:
ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá
áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa
substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x
concentração) da substância padrão:
PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no
cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração
dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com
concentrações próximas da concentração esperada na
amostra. Outro fator muito importante é que o volume
injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume
injetado de amostra. Por esta razão este tipo de
padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas
para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume
injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para
corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente
com um padrão de massa conhecida. Esta
mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos
no cromatograma, compara-se a área corrigida
de cada componente que se deseja determinar
com a área corrigida do padrão adicionado, do
qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x
PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que
possível, entre compostos semelhantes aos que
existem na amostra, não devendo coincidir com
nenhum composto da mesma, e estar próximo ou
entre os picos da amostra. Deve ser também uma
substância pura para que apresente apenas um pico
no cromatograma, e para que esse pico possa ser
relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de
apenas um dos componentes de uma mistura, sem
haver necessidade de conhecer os outros
componentes.
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
ReferênciasReferências
 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;
VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin.
Determinação de corantes marcadores do tipo azo e
antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida
com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010,
vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.

AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A
BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE
LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia
Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme
Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5,
Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins
Ribeiro6

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Cromatografia liquida

  • 1. Cromatografia Liquida – CLAECromatografia Liquida – CLAE professora ; adrianne mendonçaprofessora ; adrianne mendonça
  • 2. O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ? Definição: A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária. A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .
  • 3. O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a Líquido HPLC?HPLC? Definição: Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido . O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.
  • 5. CLAE -HPLCCLAE -HPLC Fase móvel (amostra) Fase estacionária (Componentes retidos) Migrações diferenciais Analitomov ⇋ Analitoest K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição
  • 7. INSTRUMENTAÇÃO pump injector column oven detector One pump used to control 4 reservoirs; mixing is done before pump. MIXER data processor Fase móvel
  • 8. Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC PURGAINJETOR COLUNA FM BOMBA DETECTOR
  • 9. Componentes de umComponentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLCCromatógrafo a Líquido HPLC Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais :  Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel ;  Coluna cromatografia : É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ;  Detector : É o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas
  • 10. Componentes auxiliares deComponentes auxiliares de um HPLCum HPLC Bomba : É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente ); É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas. Fornece uma alta pressão.
  • 11. BOMBA - Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min) - Opções: Simples, gradiente binário, quaternário - Mede a pressão sobre o sistema - Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
  • 13. Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de um HPLCHPLC Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição .
  • 15. Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas Fases estacionárias :  Sílica- C8  Sílica- C18  Sílica- C18 ( ODS)  Sílica- NH2  Sílica- Diol  Sílica  Troca Iônica  Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca  Resinas DVB-ST porosas Pré-Coluna:  É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .  Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
  • 16. SÍLICA (suporte + usado): - Resistência mecânica - Variedade de forma, tamanho de partículas e poros - Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
  • 17. Si OH Si HO OH Si OH Si OH SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS LIVRES GEMINAL VICINAIS influenciam no grau de acidez da sílica
  • 18. Fase EstacionáriaFase Estacionária A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
  • 19. MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL - QUIMICAMENTE LIGADAS - HÍBRIDAS - RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
  • 20. Fases Quimicamente Ligadas C18 (ODS) forte C8 amostra amostra amostra C4 média fraca
  • 21. POLIMÉRICAS Pré-hidrólise do agente silanizante - Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
  • 22. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS Matriz orgânica-inorgânica - Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais - Menor quantidade de grupos de silanóis - Ultra-fast cromatografia Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano (RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
  • 23. RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS -RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA - SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS
  • 24. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte - Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) • Poli(etileno) • Poli(butadieno) • Poli(estireno) • Poli(dimetilsiloxano) • Poli(metiloctilsiloxano) • Poli(metiloctadecilsiloxano) • Poliéteres • Polissacarídeos • Poliaminas • Polinucleotídeos • Poliamidas • Proteínas Sílica Zircônia Titânia Alumina
  • 25. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO) INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
  • 26. Fases estacionárias Interações C8 PH C2 van der Waals van der Waals van der Waals Si Si Si
  • 27. Fases estacionárias Interações CN NH2 2OH Dipolo/Dipolo O H Si N H H OSi O H OO H H Si N O H C Ligação de hidrogênio Ligação de hidrogênio Fase Estacionária
  • 29. Processo de EluiçãoProcesso de Eluição Definição: Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária. Série eluotrópica  Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
  • 30. Força eluente:  É uma medida da energia de adsorção do solvente Cromatografia com fase normal:  Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar. Cromatografia com fase reversa:  Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.
  • 31. DETECTORES - Classificação UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
  • 33. É mais comum, usado na CLAE.  Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.  São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes. DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:
  • 34. Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. - Seletivo (moléculas com cromóforos) - Comprimento de onda (λ) fixo - λ pode ser selecionado (190 – 600 nm) - Varredura (DAD) - Solventes também absorvem Ultra violeta (UV-visível): Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF 190 210 200 330 200 245 215 λ nmSolvente
  • 35. Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV - Seletivo (moléculas que fluorescem) - Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas - Mais sensível que UV por ser emissão - Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente. - Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila Fluorescência:
  • 37. Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
  • 38. Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna - Não- seletivo - Sensível a variações de: - Temperatura - Pressão - Fluxo - Composição fase móvel - Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar - Muito usado em cromatografia preparativa Indice de refração:
  • 39. Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z) - Destrutivo - Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS) - Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI - Análise de micro e macromoléculas. - Alta sensibilidade Espectrometria de massas:
  • 41. MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃO NORMAL REVERSO TROCA IÔNICA
  • 42. MODO NORMAL MECANISMO DE INTERAÇÃO: ADSORÇÃO Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel Fase móvel: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
  • 43. MODO REVERSO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA HIDROFOBICIDADE Fase estacionária: APOLAR Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
  • 44. Tempo de Retenção e Hidrofobicidade OH OH C18 (ODS) forte Interação fraca
  • 45. HidrofobicidadeHidrofobicidade  Se a amostra possui  CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica  : grupo aromático  Se a amostra possui  -COOH : grupo carboxílico  -NH2 : grupo amino  -OH : grupo hidróxi A hidrofobicidade será forte A hidrofobicidade será fraca
  • 46. TROCA IÔNICA MECANISMO DE INTERAÇÃO : ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
  • 47. Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Obs: Seringa de HPLC
  • 48. SeqüênciaSeqüência Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras
  • 49. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS FATOR DE RETENÇÃO (k) FATOR DE SEPARAÇÃO (α) NÚMERO DE PRATOS (N)
  • 50. Cromatograma tR tM TEMPO SINAL tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
  • 51. A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
  • 52. w 2 na linha de base BANDA CROMATOGRÁFICA
  • 53. Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases Não leva em conta o tempo morto da coluna FATOR DE RETENÇÃO (k) tr – to k = to tr = tempo retenção analito to = tempo morto da coluna
  • 54. t r o o k = t t Se: t0 = 1,5 min t1 = 3,5 min t2 = 4,2 min k1 = 1,3 k2 = 1,8
  • 55. FATOR DE SEPARAÇÃO (α) α k2 = k1 AVALIA A SELETIVIDADE
  • 56. Se: k1 = 1,3 k2 = 1,8 α = 1,38 k1 = 1,3 k2 = 1,8 α k2 = k1 α = 1 não houve separação
  • 57. NÚMERO DE PRATOS (N) Mede a eficiência do sistema Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel tr N= 5,54 w0,5 2
  • 58. ResoluçãoResolução é função da Seletividade (α) Eficiência da coluna (N) Fator de retenção (k)
  • 59. ResoluçãoResolução Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
  • 61. FASE MÓVEL - Solvente grau HPLC (alta pureza) - Filtração (membrana 0.45 μm) - Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático) - Purgar os solventes
  • 62. MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO: Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE. GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida. - Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
  • 63. Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico a b c d a b c d [ MeOH/H2O ] par crítico : c,d [ THF/H2O ] par crítico : a,b a b c d [ MeOH/THF/H2O ]
  • 64. 1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..) 2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE) 3) EXTRAÇÃO: - LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE) PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
  • 65. FiltraçãoFiltração É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 µm mesh para a remoção do material insolúvel.
  • 66. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito
  • 67. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector Cálculo de área:
  • 68. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA Se ambos os compostos respondessem igualmente ao detector poderíamos usar a relação: Massa A Área A Massa B Área B No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
  • 69. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão. Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:
  • 70. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra. É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
  • 71. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração. Mx = massa do componente x Ma = massa da amostra Mp = massa do padrão Ap = área do padrão Ax = área corrigida do componente x
  • 72. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.
  • 76. ReferênciasReferências  TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.  AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6