Cromatografia

INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em
propriedades físicas
(químicas em alguns casos )
Chamados de
métodos de via
úmida
Gravimetri
a
Volumetri
a
Eletroanalíti
co
Propriedade
s elétricas
Espectrométr
ico
Propriedad
es ópticas
Cromatográfi
co
Propriedad
es mistas*
*Separação: interações físico-químicas.
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.

Histórico
Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botânico russo: Separação de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e
solventes variados.éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de separação de
misturas. A identificação e quantificação de seus
componentes fica por parte do detector.
• A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas
fases é influenciada por diferentes forças
intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e
específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da interação
de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de curvas
analíticas.
Cromatografia

Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• Cromatografia Gasosa
• Cromatografia Supercrítica
• Planar
• Centrífuga (Chromatotron®)
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia

• De acordo com a fase móvel
• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás Pressurizado
• Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia

• De acordo com a Fase Estacionária
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separação
• Por Adsorção
• Por Partição
• Por Troca Iônica
• Por Afinidade
Cromatografia

Cromatografia
Técnica Planar Coluna
FM
FE
Líquido
Líq Sól
Gás Líquido
Líq Sól
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
ExclusãoFase
Ligada
Troca
Iônica
SólLíq Afinidade
Tipo de
cromato-
grafia

Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Na Cromatografia líquida a fase móvel é um líquido
que se desloca sobre uma fase sólida (estacionária).
Pode ser dividida em duas partes. Cromatografia
planar e cromatografia em colunas. Na cromatografia
planar temos a Cromatografia em Papel (CP, em inglês
PC) e a Cromatografia em Camada Delgada (CCD em
inglês TLC).
Na cromatografia em colunas temos a
Cromatografia Líquida clássica (CL, em inglês LC) e a
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, em
inglês HPLC).

Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel
Separação
Cromatografia
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos
(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Cromatografia
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.

•Cromatografia em papel (CP): Método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, em função do deslocamento diferencial de
solutos, arrastados por uma face móvel, sendo retidos seletivamente por uma
fase estacionária liquida (água), na cromatografia com fase normal.
•Suporte: Papel sobre o qual fica retida a fase estacionária, água.
•Fase móvel: Um liquido ou mistura de liquides que fluem através do papel,
arrastando os solutos.
•Revelador ou Agente Cromatográfico: Agente físico (U.V., por exemplo) ou
quimico (por ex., vapores de iodo) que tornam visíveis as substâncias
separadas pela cromatografia em papel.
•Resolução: Distância mínima em que se encontram duas manchas sendo
ainda possível distingui-las individualmente.
•Desenvolvimento: É o movimento diferencial dos componentes de uma
amostra, ao serem deslocados pela Fase móvel Em função de sua direção
podemos ter: ascendente, de baixo para cima; descendente, de cima para
baixo; horizontal, do centro para a periferia conforme um circulo imaginário
traçado no plano horizontal.
DEFINIÇÕES E TERMOS USADOS EM
CROMATOGRAFIA EM PAPEL

•Aplicação: Colocação da solução da amostra (mistura das substâncias) no
ponto de partida sobre o papel cromatográfico.
•Frente da fase móvel: Linha de chegada da fase móvel, visível ainda
quando se retira o papel da cuba cromatográfica.
•Distância percorrida: Distância percorrida pela fase móvel, desde o ponto
de partida ate a linha de chegada (geralmente 10 cm) ou a do componente,
no mesmo tempo.
•Rf: O quociente entre as distâncias percorridas simultaneamente desde o
ponto de partida, ate o centro de maior concentração da mancha do soluto e
ate a frente da fase móvel.
•Câmara ou Cuba cromatografica: Recipiente de vidro com tampa fechada
hermeticamente, não deixando escapar vapores da fase móvel e onde
coloca-se o papel de cromatografia.
•Cromatograma: Papel com as substancias separadas.
•Saturação da cuba: Distribuição uniforme no interior da cuba da fase vapor
da fase móvel apôs alcançado o equilíbrio (para obter-se a saturação deve-
se colocar papéis de filtro, embebidos na fase móvel, aderidos as paredes
laterais internas das cubas).

PAPEL
O suporte na cromatografia em papel é uma tira retangular ou uma folha
circular de papel que funciona como uma camada fina de celulose.
Para usos especiais é preferível modificar-se o papel os mais utilizados
são:
Papel acetinado - útil para separar substâncias hidrófilas.
Papel impregnado - empregam-se na separação de substâncias
moderadamente hidrófobas ou hidrófilas. O papel é umedecido ou com
silicone, ou com parafina, ou com dimetilformamida ou aminas de alto
peso molecular.
Papel carregado - dispersão de resinas poliestirênicas, trocadoras de
ions, nas fibras de celulose, permitindo a separação de substâncias
orgânicas e inorgânicas.
Papel de fibra de vidro - as fibras de celulose são substituídas por
fibras de vidro, usa-se para condições extremas de temperatura e de
acidez e devem ser impregnados com suspensões aquosas de sílica gel ou
alumina.
Papel tratado - para substâncias anfóteras ou com muitas hidroxilas.

Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia

Termos e parâmetros técnicos
Cromatografia
solvente
mancha
f
ΔS
ΔS
R 
s
a
R af 
s
b
Rbf 
s
c
Rcf 
c
b
a
s

Cromatografia
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Alumina (Al2O3)
Celulose
Poliamida
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Ativação de 10 min
a 105 oC

Cromatografia
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de Rf tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjunto
- Extração e aplicação de métodos instrumentais

Cromatografia
A B Após
Eluição
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença,
eluir em outros solventes
Conclusões:
Amostra

Cromatografia
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Bi-dimensional

Cromatografia planar
Cromatografia
Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.

Aplicações:
 Estudos preliminares dos componentes de
um extrato orgânico;
 Investigação de casos de envenenamento e
ingestão de estimulantes por atletas;
 Estudos de reações químicas quanto à
presença de intermediários estáveis;
 Análise da pureza de compostos;
 Análise da eficiência de processos de
destilação e cristalização.
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Tammy

Vantagens:
 Fácil execução;
 Rapidez;
 Menor trajeto da fase móvel ;
 Baixo custo;
 Versatilidade.
Desvantagens:
 Difícil reprodutibilidade;
 Difícil determinação precisa do Rf.
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Tammy

Cromatografia
Cromatografia em Coluna

Cromatografia
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão
Adsorção
Partição
Troca Iônica
Afinidade

Cromatografia
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de
Adsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals

Cromatografia
Diferença entre Absorção e Adsorção

Cromatografia
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Cromatografia
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção
tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

Cromatografia
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa
e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
ADSORÇÃO

Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.

Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.

Cromatografia
TROCA IÔNICA
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica
Adsorção reversível e
diferencial dos íons da fase
móvel pelo grupo trocador
da matriz
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de
extraordinário valor em processos analíticos.

Cromatografia
Maior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
FE altamente carregada
FluxodaFM
A diferença de afinidade entre
os íons da FM pode ser
controlada por pH e força iônica

Cromatografia
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas

Cromatografia
EXCLUSÃO
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas
cavidades, as maiores vão sendo eluídas
contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar

Cromatografia
EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo
quanto mantido em condições
brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem no
processo de separação.

Cromatografia
EXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
FluxodaFM

Cromatografia
Fase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
AFINIDADE

Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
FASE
ESTACIONÁRIA
FASE
MÓVEL ⇌
Sem
importância
na CG, mas
com grande
importância
na CLAE

Teoria Básica
Cromatografia
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase
móvel:
 
 FM
FE
C
A
A
K 
KC = Constante de Distribuição
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito
sorvido na FE e dissolvido na FM.
MENOR RETENÇÃO !!!
Volatilidade [A]FM
Afinidade pela FE [A]FE

Quantificação da eficiência
Cromatografia
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada “estágio” de equilíbrio é
chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teóricos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:
Coluna mais
eficiente
tR
wb
N

Quantificação da eficiência
Cromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
“Tamanho” de cada estágio de
equilíbrio
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas
como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais
eficientes
(L = comprimento da coluna)
Valores típicos de H e N:
dC df H N
0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
2,16 5% 0,500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em mm

Resolução
Uma outra medida quantitativa de separação de dois
componentes consecutivos num cromatograma
é a resolução ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e
calculada a partir da distância que separa os
máximos dos picos divididos pela média das larguras de suas
respectivas bases, conforme apresentado na
Figura 4. A resolução de uma coluna é uma medida quantitativa
de sua habilidade em separar dois
solutos, e é definida por :
RS = ( tRB – tRA ) / [ ( WA / 2) + ( WB / 2 ) ] =
2 ( tRB – tRA ) / ( WA + WB )

Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Detecção

Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
Fase móvel:
gás inerte
Detector:
submetido à
temperatura
controlada
Injetor: submetido
à temperatura
controlada

Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.

Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidrolisa algumas FE
incompatíveis detector de
captura eletrônica
H2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de
altíssima pureza
podem ser muito
caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda
um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de
Arraste em Função
do Detector:
He , H2DCT
DIC N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CUSTO
PUREZA
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)

Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x

Injetor “on column”
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de
arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna
cromatográfica

Injetor “on column”
1 2 3
1 - Ponta da agulha
da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
início da coluna.
3 - “Plug” de vapor
de amostra forçado
pelo gás de arraste a
fluir pela coluna.

Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra.
COLUNA
Amostras
Gasosas
Amostras
Líquidas
empacotada
 = 3,2 mm (1/4”) 0,1 mL ... 50 mL0,2 mL ... 20 mL
capilar
 = 0,25 mm 1 mL ... 100 mL0,01 mL ... 3 mL
Sólidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a solução

LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microsseringa de
10 m L:
Microsseringa de 1 m L
(seção ampliada):
corpo
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
agulha
Microsseringas para injeção

Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida
depositada sobre as partículas do
recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (fração de mm) de
FE líquida ou sólida

Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0).
p0 = f
Estrutura química do analito
Temperatura
da
coluna
Pressão
de
vapor
Velocidade
de
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE
(MENOR RETENÇÃO)

AUMENTODA
TEMPERATURADACOLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG

Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL
BAIXA:
- Componentes mais voláteis são
separados
- Componentes menos voláteis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis não
são separados
- Componentes menos voláteis
eluem mais rapidamente

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em menor
tempo
TEMPO
TEMPERATURA
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
TINI - Temperatura Inicial
TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotérmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento

Programação linear de
temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180 ºC

VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gás
aumenta com a temperatura.
viscosidade vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilização de
FE líquida
Possíveis problemas associados à PLT:

Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes
da amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de
boa eficiência

Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais
(partículas finas, poros)
• Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios
ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
ADSORÇÃO

Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior
do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
• Grande superfície líquida exposta ao gás
de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o
analito (grande solubilidade)
ABSORÇÃO

Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem
diferencialmente com os isômeros óticos.
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos
têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de
origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).

Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais (desejáveis):
1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. Não destrutivo.

Detectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
REGISTRO
DE
SINAL
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores

Detectores
UNIVERSAIS:
Geram sinal para
qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas
substâncias
com determinada
propriedade
físico-química.
ESPECÍFICOS:
Detectam
substâncias que
possuam
determinado
elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas
DCT DCE DNP

Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de
moléculas com N e P.

Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico.
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)

Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa.
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de
determinada razão m/z.
Detecção
TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
Cromatograma de íons totais:
TIM (monitoramento de íons
totais) ou TIC (
cromatograma de íons totais)
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
Cromatograma de íons
selecionados: SIM
Em cada posição do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada. MASSA / CARGA
CONTAGENS
Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os
demais.

CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG EM
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vácuo.
Câmara
de Ionização
Coluna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a
vazão baixa de gás de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vácuo.

Análise qualitativa
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR = Tempo de Retenção (tempo
decorrido entre a injeção e o ápice
do pico cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo
mínimo para um composto que não
interaja com a FE atravesse a
coluna)
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado
(tempo médio que as moléculas do
analito passam sorvidas na FE)

Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 mL
Como se explica esta
ordem de eluição?
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.
1. A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor e).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenças de polaridade
não são elevadas, a volatilidade
se torna o principal parâmetro
que define a ordem de eluição.

Análise quantitativa
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois
a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
AlturaÁrea

tempo
Concentração
Área
amostra

MASSA
ÁREA
A partir de certo
ponto o sinal não
aumenta mais
linearmente
O fim da zona de linearidade pode
ser detectado quando a razão
(Área / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinação da reta na
região linear:
MASSA
ÁREA/MASSA
0,95 S
1,05 S

tempo
amostra
Concentração Adicionada
Área
concentração
na amostra

Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida

Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar
de 32 até 4000000.
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido
ela deve dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.

Tipos e
Aplicações da
Cromatografia
Líquida
Insolúvel em água Solúvel em água
Aumento de polaridade
Polar não iônico
Apolar Iônico
Massamolecular
102
103
104
105
106
Troca
iônica
Partição
Partição
em fase
reversa
Partição
em fase
normal
Exclusão
Permeação
em gel
Filtração
em gel
Adsorção

Componentes típicos - CLAE

Esquema de um equipamento para CLAE

Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de
bombas de pistão ou de diafragma)

Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Sistemas de injeção de amostras

• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de
composição constante.
• Eluição com gradiente:
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é
variada de modo programado, de forma contínua ou em
passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programação de temperatura na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
Fase móvel para CLAE

Eluição com gradiente Coluna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425 nm

 VISCOSIDADE
 COMPATIBILIDADE COM TIPO DE DETECTOR
UTILIZADO
 POLARIDADE DA FASE MÓVEL
 MISCIBILIDADE

 A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de
grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta
sensibilidade com detectores por fluorescência ou por
absorbância no ultravioleta, onde as impurezas da fase móvel
podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os
componentes da amostra.
 No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar
com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no
frasco dentro de banho ultra-som por, no mínimo, 15
minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser
preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse
tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água
e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e depois
desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água a
desgaseificação deve ser feita em temperatura baixa devido à
grande volatilidade da acetonotrila.

 Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase
móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto,
satura-se a fase móvel com a fase estacionaria
utilizando-se para isso uma pré-coluna contendo uma
alta concentrado da mesma fase estacionaria.
 Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para
que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre
o sistema abundantemente e passar um agente de
esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise
de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada.
 O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com
solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser
dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha
com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão
da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado
pode danificar o corpo do pistão

Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Colunas para CLAE
Pré-coluna
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna
COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 mm
•Eficiência: 40 mil a 60 mil
pratos/metro

Separação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 mm
Coluna de alta
velocidade e
alta eficiência
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano
100.000 pratos/metro

• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica (ou sílica modificada)
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3
a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
Basicamente são dois tipos de FE:
Fase estacionária para CLAE

A superfície de sílica, que é o suporte mais popular, pode ser
modificada por um destes caminhos, entre outros:
a) Formação do éster silicato (Si-O-R) por reação do grupo
silanol com um álcool:
Si-OH + ROH  Si-O-R + H2O
b) Formação de ligação siloxano (Si-O-SiR3) por reação do
grupo silanol com um organoclorosilano:
Si-OH + R3SiCl  Si-O-SiR3 + HCl
c) Formação da ligação sílicio-carbono pelo tratamento do
grupo silanol com cloreto de tionila, para produzir o cloreto,
que, em seguida, reage com um composto organometálico para
produzir um grupo orgânico ligado diretamente à superfície
da sílica:
Si-OH + SOCl  Si-Cl + SO2 + HCl
Si-Cl + RLi  Si-R + LiCl

Preparação da Fase Ligada
Sílica
Reação de
Silanização
Octadecilsilano

M+ + R-SO3
- Na+ ↔ Na+ + R-SO3
-M+
Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca iônica,
são:
-SO3
- -trocadores fortes de cátions
-CO2
- -trocadores fracos de cátions
-NR3
+ -trocadores fortes de ânions
-NH2R+ - trocadores fracos de ânions

TÉCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS
O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a
seco ou usando uma suspensão da fase estacionária em
um solvente apropriado. Sendo que as pequenas
partículas, durante o enchimento a seco com vibração,
tendem a formar aglomerados, produzindo um acumulo
das partículas maiores perto da parede e das menores no
centro da coluna, o método de enchimento por suspensão
com alta pressão e preferido para rechear colunas com
partículas de diâmetro menor do que 25 µm.

Bombas Recíprocas
Escoam volumes constantes de forma não contínua - pulsante.
Sistema de Operação
Através do movimento de um pistão (movimentado por um eixo
excêntrico) e através de um sistema de válvulas que
alternadamente se abrem e fecham, onde se enche e esvazia uma
pequena câmara, de modo alternativo.
Volume interno de 100-200 μL.

•Os pistões são de safira, que confere resistência ao ataque da
maioria dos solventes utilizados em CLAE, precações solução tampão;
• O selo do pistão é um disco de teflon fixo no interior do corpo da
bomba, feito de aço inoxidável quimicamente resistente.
Selos com o tempo de uso começam a apresentar vazamentos na
bomba por isso devem ser substituídos;
• As bolas das válvulas são de rubi aparada em base de safira,
formando um selo.
•A pressão dentro do reservatório da bomba é a responsável pela
abertura e o fechamento do selo.
•Bombas Recípocras : Pistão Simples ou Duplo

Pistão Simples
Vantagens
Geram altas pressões e vazões de volume constante;
Compatibilidade com eluição por gradiente e reservatório sem
limite de volume (alimentada continuamente pela FM);
Desvantagens
Sofre cavitação (formação de bolhas durante o movimento dos
pistões), devido a compressibilidade dos líquidos;
Vazão pulsante e não de forma contínua e uniforme – decorrente do
movimento de ida e volta do pistão;
Perda na eficiência da coluna e instabilidade do detector – deve
usar um amortecedor de pulso.

Pistão Duplo
Dois pistões são acionados por um mesmo eixo excêntrico, de
forma que, quando um pistão succiona a FM, o outro expulsa o
líquido para fora da bomba.
Vazão de ambos os pistões, já quase livre de pulsação, é
encaminhada à coluna por uma via comum.
Sistema de duplo pistão tem todas as vantagens da pistão simples,
além da vantagem adicional da grande diminuição do problema de
pulsação.

Bombas do Tipo Seringa
Chamadas também de êmbolo ou de deslocamento contínuo.
Possuem um êmbolo ou pistão que é deslocado de forma contínua
e uniforme por um motor de precisão, comprimindo o líquido
contido em uma câmara de volume constante.
Vantagens –apresenta altas pressões, não apresentam pulsação e
possuem fluxo constante da FM.
Desvantagem – o reservatório de solvente limitado, o que
dificulta o preenchimento e a mudança da FM, pois implica parar
o sistema e despressurizar.
Poucos instrumentos empregam esse tipo de bomba, devido ao
alto custo e as vantagens das bombas recíprocas.

Bombas Pneumáticas
•Esta bomba tem um pistão que se movimenta pela ação de agente
pneumático.
•O reservatório da bomba é cheio pela força do ar comprimido,
que desloca o pistão ou diafragma.
•As vazões obtidas são livres de pulsações e de pressão constante,
isso significa que, se a resistência à pressão da coluna muda, a
vazão também muda.
•As desvantagens deste sistema são:
-Instabilidade na velocidade do fluxo;
-Mudanças no tempo de retenção, dificultando a interpretação
dos resultados;
- Capacidade limitada do volume total que pode ser bombeado.

Detectores
As características desejáveis para os detectores
para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou
constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.

Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103
• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104

Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106

Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM

Detectores
• Espectrometria de massa
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TEMPO
CONTAGENS MASSA / CARGA
CONTAGENS
TIC
SIM

Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como
um gás ideal e não contribui para o processo de
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.

Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.

Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)

Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas
policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue,
narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos

Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de
HPLC.
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade
de troca iônica.
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico,
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas,
são capazes de promover a separação de acordo com os
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.

Tabela 1 -Comparação entre as características da CG e CLAE
Fator CG CLAE
Requisitos para
amostra
Amostra ou derivado
volátil, termicamente
estável .
Amostra solúvel na fase
móvel.
Tipos de amostra Gases, líquidos e
sólidos; MM – 2 a
1.200 g mol-1
Líquidos e sólidos, iônicos
ou covalentes; MM – 32 a
4.000.000 g mol-1
Quantidades
mínimas detectáveis 10-10 g a 10-13 g 10-10 g a 10-12 g
Tempo de Análise Minutos até uma hora Minutos até poucas horas
Números de pratos
por coluna
2.000 (recheadas)
50.000 (capilares)
5.000 a 25.000
(recheadas)

Fator CG CLAE
Capacidade
Preparativa
Pobre, necessitando
de múltiplas injeções
Boa, com facilidade de
coleta e capacidade de
mecanização;
Capacidade Analítica Excelente, separação
de amostra com até
200 componentes
Excelente, separação com
até 100 componentes eum
uma amostra
Grau de dificuldade
e manuseio do
equipamento
Relativamente fácil Requer maior tempo de
treinamento, devido ao
conjunto de diferentes
modalidades.
Além desses parâmetros;
CLAE - 2 fases cromatográficas (FE e FM) e CG apenas (FE);
Possui maior variedade de FE que atuam em diversos
mecanismos de separação;
Permite a separação de compostos termicamente instáveis;

CLAE e CG não são Competitivas
Duas técnicas se complementam e analisam diferentes tipos
de amostras .
Vantagens da CLAE
Determinação de moléculas de ampla faixa de massas molares;
Sensibilidade variando de nanogramas a picogramas;
Raramente necessita de derivatização;
Pode analisar amostras com n compostos diferentes;
Combinação de velocidade, reprodutibilidade e sensibilidade.

Tabela 2- Vantagens e limitações da CLAE
Aplicações
Análise alimentos, medicamentos, herbicidas, combustíveis, sangue,
urina, plantas, etc, com o mínimo de purificação e modificação;
Geralmente o único procedimento de amostragem é a ultra-
filtração;
Pré-concentração da amostra;

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