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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em
propriedades físicas
(químicas em alguns casos ...
Histórico
Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botânico russo: Separação de misturas de pigm...
Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de separação de
misturas. A identificação e quantifi...
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• ...
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a fase móvel
• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• ...
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a Fase Estacionária
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
•...
Classificação das técnicas cromatográficas
Cromatografia
Técnica Planar Coluna
FM
FE
Líquido
Líq Sól
Gás Líquido
Líq Sól
C...
Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁ...
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Na Cromatografia líquida a fase móvel é um líquido
que se desloca sobre uma fase sólida (estacionári...
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na cel...
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Cromatografia
Desenvolvida por Consden, Go...
•Cromatografia em papel (CP): Método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, em função do deslocamento...
•Aplicação: Colocação da solução da amostra (mistura das substâncias) no
ponto de partida sobre o papel cromatográfico.
•F...
PAPEL
O suporte na cromatografia em papel é uma tira retangular ou uma folha
circular de papel que funciona como uma camad...
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largam...
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
Cromatografia
solvente
mancha
f
ΔS
ΔS
R 
s
a
R af 
s
...
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Alumina (Al2O3)
Celulose
Poliamida
A...
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de Rf tabelados
- Compara...
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
A B Após
Eluição
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a ...
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Bi-dimensional
Cromatografia planar
Cromatografia
Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. ...
Aplicações:
 Estudos preliminares dos componentes de
um extrato orgânico;
 Investigação de casos de envenenamento e
inge...
Vantagens:
 Fácil execução;
 Rapidez;
 Menor trajeto da fase móvel ;
 Baixo custo;
 Versatilidade.
Desvantagens:
 Di...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão
Adsorção
Partição
Troca Iônica
Afinidade
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de
Adsorção/D...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Diferença entre Absorção e Adsorção
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Toluen...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiai...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O pro...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O pr...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica
A...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Maior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
TROCA IÔNICA
Resinas Ca...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores ...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por vo...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver um...
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
FluxodaFM
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
AFI...
Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
FASE
ESTACIONÁRIA
FASE
MÓVEL ⇌
Sem
importância
na CG, mas
com grande
importância
na CLAE
Teoria Básica
Cromatografia
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o anal...
Quantificação da eficiência
Cromatografia
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre...
Quantificação da eficiência
Cromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
“Tamanho” de cada estágio de
equilíbri...
Resolução
Uma outra medida quantitativa de separação de dois
componentes consecutivos num cromatograma
é a resolução ( RS ...
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Detecção
Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
...
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEI...
Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionária ou superfícies do
inst...
Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de
altíssima pureza
podem ser muito
caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada det...
Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra ...
Injetor “on column”
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de
arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta ...
Injetor “on column”
1 2 3
1 - Ponta da agulha
da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e v...
Parâmetros de injeção
Cromatografia Gasosa
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vap...
Cromatografia Gasosa
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microssering...
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líqu...
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a colu...
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
AUMENTODA
TEMPERATURADACOLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESS...
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferente...
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separ...
Cromatografia Gasosa
Programação linear de
temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ...
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gás
aumen...
Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos s...
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é...
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida...
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES ...
Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passage...
Cromatografia Gasosa
Detectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um ...
Cromatografia Gasosa
Detectores
UNIVERSAIS:
Geram sinal para
qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas
substâ...
Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Supressão de corrente causa...
Cromatografia Gasosa
Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde mu...
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detect...
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
Cromatogram...
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
Cromatograma de íons
selecionados: ...
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG EM
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve
(He) difunde ma...
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de...
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID:...
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Alt...
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
tempo
Concentração
Área
amostra
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
MASSA
ÁREA
A partir de certo
ponto o sinal não
aumenta mais
linearmente
O fim da...
Cromatografia Gasosa
tempo
amostra
Concentração Adicionada
Área
concentração
na amostra
Análise quantitativa
Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou c...
Cromatografia Líquida
Tipos e
Aplicações da
Cromatografia
Líquida
Insolúvel em água Solúvel em água
Aumento de polaridade
...
Componentes típicos - CLAE
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência ...
Cromatografia Líquida
Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Sistemas ...
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de
composição constante.
• Eluição com gra...
Cromatografia Líquida
Eluição com gradiente Coluna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 4...
 VISCOSIDADE
 COMPATIBILIDADE COM TIPO DE DETECTOR
UTILIZADO
 POLARIDADE DA FASE MÓVEL
 MISCIBILIDADE
 A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de
grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta
sens...
 Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase
móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto,
sat...
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com pared...
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
Pré-coluna
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
•Contaminan...
Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftala...
• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm,...
A superfície de sílica, que é o suporte mais popular, pode ser
modificada por um destes caminhos, entre outros:
a) Formaçã...
Preparação da Fase Ligada
Sílica
Reação de
Silanização
Octadecilsilano
M+ + R-SO3
- Na+ ↔ Na+ + R-SO3
-M+
Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca iônica,
são:
-SO3
- -trocadores fort...
TÉCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS
O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a
seco ou usando uma suspensão da fase...
Bombas Recíprocas
Escoam volumes constantes de forma não contínua - pulsante.
Sistema de Operação
Através do movimento de ...
•Os pistões são de safira, que confere resistência ao ataque da
maioria dos solventes utilizados em CLAE, precações soluçã...
Pistão Simples
Vantagens
Geram altas pressões e vazões de volume constante;
Compatibilidade com eluição por gradiente e re...
Pistão Duplo
Dois pistões são acionados por um mesmo eixo excêntrico, de
forma que, quando um pistão succiona a FM, o outr...
Bombas do Tipo Seringa
Chamadas também de êmbolo ou de deslocamento contínuo.
Possuem um êmbolo ou pistão que é deslocado ...
Bombas Pneumáticas
•Esta bomba tem um pistão que se movimenta pela ação de agente
pneumático.
•O reservatório da bomba é c...
Cromatografia Líquida
Detectores
As características desejáveis para os detectores
para CLAE não são diferentes daquelas pa...
Cromatografia Líquida
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/...
Cromatografia Líquida
Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explo...
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrô...
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TEMPO
CONTAGENS MASSA /...
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como
um gás ideal e não contribui para o pro...
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a F...
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo ...
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
B...
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma
clássica da CL introduzida...
Tabela 1 -Comparação entre as características da CG e CLAE
Fator CG CLAE
Requisitos para
amostra
Amostra ou derivado
volát...
Fator CG CLAE
Capacidade
Preparativa
Pobre, necessitando
de múltiplas injeções
Boa, com facilidade de
coleta e capacidade ...
CLAE e CG não são Competitivas
Duas técnicas se complementam e analisam diferentes tipos
de amostras .
Vantagens da CLAE
...
Tabela 2- Vantagens e limitações da CLAE
Aplicações
Análise alimentos, medicamentos, herbicidas, combustíveis, sangue,
uri...
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC)
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Cromatografia

  1. 1. INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
  2. 2. Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos ) Chamados de métodos de via úmida Gravimetri a Volumetri a Eletroanalíti co Propriedade s elétricas Espectrométr ico Propriedad es ópticas Cromatográfi co Propriedad es mistas* *Separação: interações físico-químicas. Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
  3. 3. Histórico Cromatografia Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados.éter de petróleo CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados 1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
  4. 4. Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas. A identificação e quantificação de seus componentes fica por parte do detector. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. • A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. • A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas. Cromatografia
  5. 5. Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP) Cromatografia
  6. 6. Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC) Cromatografia
  7. 7. Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação • Por Adsorção • Por Partição • Por Troca Iônica • Por Afinidade Cromatografia
  8. 8. Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Técnica Planar Coluna FM FE Líquido Líq Sól Gás Líquido Líq Sól CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE ExclusãoFase Ligada Troca Iônica SólLíq Afinidade Tipo de cromato- grafia
  9. 9. Cromatografia Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
  10. 10. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Na Cromatografia líquida a fase móvel é um líquido que se desloca sobre uma fase sólida (estacionária). Pode ser dividida em duas partes. Cromatografia planar e cromatografia em colunas. Na cromatografia planar temos a Cromatografia em Papel (CP, em inglês PC) e a Cromatografia em Camada Delgada (CCD em inglês TLC). Na cromatografia em colunas temos a Cromatografia Líquida clássica (CL, em inglês LC) e a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, em inglês HPLC).
  11. 11. Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Fase estacionária líquida suportada na celulose. Fase móvel Separação Cromatografia A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
  12. 12. Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Cromatografia Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
  13. 13. •Cromatografia em papel (CP): Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, em função do deslocamento diferencial de solutos, arrastados por uma face móvel, sendo retidos seletivamente por uma fase estacionária liquida (água), na cromatografia com fase normal. •Suporte: Papel sobre o qual fica retida a fase estacionária, água. •Fase móvel: Um liquido ou mistura de liquides que fluem através do papel, arrastando os solutos. •Revelador ou Agente Cromatográfico: Agente físico (U.V., por exemplo) ou quimico (por ex., vapores de iodo) que tornam visíveis as substâncias separadas pela cromatografia em papel. •Resolução: Distância mínima em que se encontram duas manchas sendo ainda possível distingui-las individualmente. •Desenvolvimento: É o movimento diferencial dos componentes de uma amostra, ao serem deslocados pela Fase móvel Em função de sua direção podemos ter: ascendente, de baixo para cima; descendente, de cima para baixo; horizontal, do centro para a periferia conforme um circulo imaginário traçado no plano horizontal. DEFINIÇÕES E TERMOS USADOS EM CROMATOGRAFIA EM PAPEL
  14. 14. •Aplicação: Colocação da solução da amostra (mistura das substâncias) no ponto de partida sobre o papel cromatográfico. •Frente da fase móvel: Linha de chegada da fase móvel, visível ainda quando se retira o papel da cuba cromatográfica. •Distância percorrida: Distância percorrida pela fase móvel, desde o ponto de partida ate a linha de chegada (geralmente 10 cm) ou a do componente, no mesmo tempo. •Rf: O quociente entre as distâncias percorridas simultaneamente desde o ponto de partida, ate o centro de maior concentração da mancha do soluto e ate a frente da fase móvel. •Câmara ou Cuba cromatografica: Recipiente de vidro com tampa fechada hermeticamente, não deixando escapar vapores da fase móvel e onde coloca-se o papel de cromatografia. •Cromatograma: Papel com as substancias separadas. •Saturação da cuba: Distribuição uniforme no interior da cuba da fase vapor da fase móvel apôs alcançado o equilíbrio (para obter-se a saturação deve- se colocar papéis de filtro, embebidos na fase móvel, aderidos as paredes laterais internas das cubas).
  15. 15. PAPEL O suporte na cromatografia em papel é uma tira retangular ou uma folha circular de papel que funciona como uma camada fina de celulose. Para usos especiais é preferível modificar-se o papel os mais utilizados são: Papel acetinado - útil para separar substâncias hidrófilas. Papel impregnado - empregam-se na separação de substâncias moderadamente hidrófobas ou hidrófilas. O papel é umedecido ou com silicone, ou com parafina, ou com dimetilformamida ou aminas de alto peso molecular. Papel carregado - dispersão de resinas poliestirênicas, trocadoras de ions, nas fibras de celulose, permitindo a separação de substâncias orgânicas e inorgânicas. Papel de fibra de vidro - as fibras de celulose são substituídas por fibras de vidro, usa-se para condições extremas de temperatura e de acidez e devem ser impregnados com suspensões aquosas de sílica gel ou alumina. Papel tratado - para substâncias anfóteras ou com muitas hidroxilas.
  16. 16. Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. Cromatografia
  17. 17. Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parâmetros técnicos Cromatografia solvente mancha f ΔS ΔS R  s a R af  s b Rbf  s c Rcf  c b a s
  18. 18. Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (SiO2) Alumina (Al2O3) Celulose Poliamida Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 oC Ativação de 10 min a 105 oC
  19. 19. Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD ANÁLISE QUALITATIVA - Comparação com valores de Rf tabelados - Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais
  20. 20. Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD A B Após Eluição Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, eluir em outros solventes Conclusões: Amostra
  21. 21. Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Solvente 1 Solvente 2 Cromatografia Bi-dimensional
  22. 22. Cromatografia planar Cromatografia Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.
  23. 23. Aplicações:  Estudos preliminares dos componentes de um extrato orgânico;  Investigação de casos de envenenamento e ingestão de estimulantes por atletas;  Estudos de reações químicas quanto à presença de intermediários estáveis;  Análise da pureza de compostos;  Análise da eficiência de processos de destilação e cristalização. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Tammy
  24. 24. Vantagens:  Fácil execução;  Rapidez;  Menor trajeto da fase móvel ;  Baixo custo;  Versatilidade. Desvantagens:  Difícil reprodutibilidade;  Difícil determinação precisa do Rf. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Tammy
  25. 25. Cromatografia Cromatografia em Coluna
  26. 26. Cromatografia Cromatografia em Coluna PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Adsorção Partição Troca Iônica Afinidade
  27. 27. Cromatografia Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals
  28. 28. Cromatografia Cromatografia em Coluna Diferença entre Absorção e Adsorção
  29. 29. Cromatografia Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Polar Aumento da Atividade -CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
  30. 30. Cromatografia Cromatografia em Coluna Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
  31. 31. Cromatografia Cromatografia em Coluna Usos: a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa e analítica. c) Laboratórios de análises clínicas  separação de esteróides de urina ou de sangue, etc. ADSORÇÃO
  32. 32. Cromatografia Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade.
  33. 33. Cromatografia Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade.
  34. 34. Cromatografia Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.
  35. 35. Cromatografia Cromatografia em Coluna Maior Interação • Íons de alta carga • Íons de menor tamanho TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas e Aniônicas FE altamente carregada FluxodaFM A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica
  36. 36. Cromatografia Cromatografia em Coluna O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
  37. 37. Cromatografia Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.
  38. 38. Cromatografia Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar
  39. 39. Cromatografia Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Características desejáveis para os Géis -Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. -Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH. -Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.
  40. 40. Cromatografia Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose FluxodaFM
  41. 41. Cromatografia Cromatografia em Coluna Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais AFINIDADE
  42. 42. Cromatografia Teoria Básica SOLUTO FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL ⇌ Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE
  43. 43. Teoria Básica Cromatografia Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:    FM FE C A A K  KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]FM Afinidade pela FE [A]FE
  44. 44. Quantificação da eficiência Cromatografia Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Coluna mais eficiente tR wb N
  45. 45. Quantificação da eficiência Cromatografia ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes (L = comprimento da coluna) Valores típicos de H e N: dC df H N 0,10 0,25 0,081 370370 0,25 0,25 0,156 192308 0,32 0,32 0,200 150000 0,32 0,50 0,228 131579 0,32 1,00 0,294 102041 0,32 5,00 0,435 68966 0,53 1,00 0,426 70423 0,53 5,00 0,683 43924 2,16 10% 0,549 3643 2,16 5% 0,500 4000 Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m dc = diâmetro da coluna em mm df = espessura da fase estacionária em mm
  46. 46. Resolução Uma outra medida quantitativa de separação de dois componentes consecutivos num cromatograma é a resolução ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e calculada a partir da distância que separa os máximos dos picos divididos pela média das larguras de suas respectivas bases, conforme apresentado na Figura 4. A resolução de uma coluna é uma medida quantitativa de sua habilidade em separar dois solutos, e é definida por : RS = ( tRB – tRA ) / [ ( WA / 2) + ( WB / 2 ) ] = 2 ( tRB – tRA ) / ( WA + WB )
  47. 47. Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Fase móvel Separação Cromatografia Detecção
  48. 48. Cromatografia em fase gasosa Cromatografia Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Injetor: submetido à temperatura controlada
  49. 49. Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
  50. 50. Requisitos - Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis detector de captura eletrônica H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC Cromatografia Gasosa
  51. 51. Requisitos - Gás de arraste (FM) CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He , H2DCT DIC N2 , H2 DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4 CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) Cromatografia Gasosa
  52. 52. Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x Cromatografia Gasosa
  53. 53. Injetor “on column” 1 2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica Cromatografia Gasosa
  54. 54. Injetor “on column” 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. Cromatografia Gasosa
  55. 55. Parâmetros de injeção Cromatografia Gasosa TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada  = 3,2 mm (1/4”) 0,1 mL ... 50 mL0,2 mL ... 20 mL capilar  = 0,25 mm 1 mL ... 100 mL0,01 mL ... 3 mL Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
  56. 56. Cromatografia Gasosa LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microsseringa de 10 m L: Microsseringa de 1 m L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha Microsseringas para injeção
  57. 57. Cromatografia Gasosa Colunas EMPACOTADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de mm) de FE líquida ou sólida
  58. 58. Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0). p0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)
  59. 59. Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna AUMENTODA TEMPERATURADACOLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
  60. 60. Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
  61. 61. Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TEMPERATURA tINI tFIM TINI TFIM R TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final tINI - Tempo Isotérmico Inicial tFIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento
  62. 62. Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC
  63. 63. Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidade vazão DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida Possíveis problemas associados à PLT:
  64. 64. Cromatografia Gasosa Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
  65. 65. Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida • Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) • Solutos polares • Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...) ADSORÇÃO
  66. 66. Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) • Filmes espessos de FE líquida • Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste • Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) ABSORÇÃO
  67. 67. Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais • As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos. FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
  68. 68. Cromatografia Gasosa Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Características ideais (desejáveis): 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. 5. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 8. Não destrutivo.
  69. 69. Cromatografia Gasosa Detectores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores
  70. 70. Cromatografia Gasosa Detectores UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas DCT DCE DNP
  71. 71. Cromatografia Gasosa Detectores - Funcionamento DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.
  72. 72. Cromatografia Gasosa Detectores – Limites de detecção DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104) DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108). DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
  73. 73. Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z. Detecção TIC Universal Similar a DCT SIM Seletivo Maior Sensibilidade
  74. 74. Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS Cromatograma de íons totais: TIM (monitoramento de íons totais) ou TIC ( cromatograma de íons totais) Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa. Detectores – Espectrometria de massas
  75. 75. Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS Cromatograma de íons selecionados: SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. MASSA / CARGA CONTAGENS Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais. Detectores – Espectrometria de massas
  76. 76. Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM. CG EM Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Câmara de Ionização Coluna Capilar Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo. Detectores – Espectrometria de massas
  77. 77. Cromatografia Gasosa Análise qualitativa tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
  78. 78. Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 mL Como se explica esta ordem de eluição? Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol. 1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. 2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e). 3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
  79. 79. Cromatografia Gasosa Análise quantitativa TEMPO SINAL O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: • Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. • Área da banda cromatográfica. AlturaÁrea
  80. 80. Cromatografia Gasosa Análise quantitativa tempo Concentração Área amostra
  81. 81. Cromatografia Gasosa Análise quantitativa MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: MASSA ÁREA/MASSA 0,95 S 1,05 S
  82. 82. Cromatografia Gasosa tempo amostra Concentração Adicionada Área concentração na amostra Análise quantitativa
  83. 83. Cromatografia em fase líquida Cromatografia Líquida
  84. 84. Cromatografia Líquida - CLAE Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000. para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
  85. 85. Cromatografia Líquida Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida Insolúvel em água Solúvel em água Aumento de polaridade Polar não iônico Apolar Iônico Massamolecular 102 103 104 105 106 Troca iônica Partição Partição em fase reversa Partição em fase normal Exclusão Permeação em gel Filtração em gel Adsorção
  86. 86. Componentes típicos - CLAE Cromatografia Líquida
  87. 87. Cromatografia Líquida Esquema de um equipamento para CLAE
  88. 88. Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)
  89. 89. Cromatografia Líquida Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 mL Microamostragem: 0,5 a 5 mL Sistemas de injeção de amostras
  90. 90. • Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente: • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. • Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos. Cromatografia Líquida A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG. Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. Fase móvel para CLAE
  91. 91. Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Coluna C18, 5 mm, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
  92. 92.  VISCOSIDADE  COMPATIBILIDADE COM TIPO DE DETECTOR UTILIZADO  POLARIDADE DA FASE MÓVEL  MISCIBILIDADE
  93. 93.  A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta sensibilidade com detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta, onde as impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra.  No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no mínimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e depois desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água a desgaseificação deve ser feita em temperatura baixa devido à grande volatilidade da acetonotrila.
  94. 94.  Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase móvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pré-coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria.  Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada.  O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão
  95. 95. Cromatografia Líquida Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
  96. 96. Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Pré-coluna •Remoção de material particulado •Contaminantes do solvente •Contaminantes da amostra •Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS •Material: aço inox •Comprimento: 10 a 30 cm •Diâmetro: 4 a 10 mm •FE: Partículas de 5 a 10 mm •Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
  97. 97. Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade 1– p-xileno 2- anisol 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 mm Coluna de alta velocidade e alta eficiência FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 100.000 pratos/metro
  98. 98. • Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica (ou sílica modificada) • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa: • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular. Cromatografia Líquida Basicamente são dois tipos de FE: Fase estacionária para CLAE
  99. 99. A superfície de sílica, que é o suporte mais popular, pode ser modificada por um destes caminhos, entre outros: a) Formação do éster silicato (Si-O-R) por reação do grupo silanol com um álcool: Si-OH + ROH  Si-O-R + H2O b) Formação de ligação siloxano (Si-O-SiR3) por reação do grupo silanol com um organoclorosilano: Si-OH + R3SiCl  Si-O-SiR3 + HCl c) Formação da ligação sílicio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila, para produzir o cloreto, que, em seguida, reage com um composto organometálico para produzir um grupo orgânico ligado diretamente à superfície da sílica: Si-OH + SOCl  Si-Cl + SO2 + HCl Si-Cl + RLi  Si-R + LiCl
  100. 100. Preparação da Fase Ligada Sílica Reação de Silanização Octadecilsilano
  101. 101. M+ + R-SO3 - Na+ ↔ Na+ + R-SO3 -M+ Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca iônica, são: -SO3 - -trocadores fortes de cátions -CO2 - -trocadores fracos de cátions -NR3 + -trocadores fortes de ânions -NH2R+ - trocadores fracos de ânions
  102. 102. TÉCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a seco ou usando uma suspensão da fase estacionária em um solvente apropriado. Sendo que as pequenas partículas, durante o enchimento a seco com vibração, tendem a formar aglomerados, produzindo um acumulo das partículas maiores perto da parede e das menores no centro da coluna, o método de enchimento por suspensão com alta pressão e preferido para rechear colunas com partículas de diâmetro menor do que 25 µm.
  103. 103. Bombas Recíprocas Escoam volumes constantes de forma não contínua - pulsante. Sistema de Operação Através do movimento de um pistão (movimentado por um eixo excêntrico) e através de um sistema de válvulas que alternadamente se abrem e fecham, onde se enche e esvazia uma pequena câmara, de modo alternativo. Volume interno de 100-200 μL.
  104. 104. •Os pistões são de safira, que confere resistência ao ataque da maioria dos solventes utilizados em CLAE, precações solução tampão; • O selo do pistão é um disco de teflon fixo no interior do corpo da bomba, feito de aço inoxidável quimicamente resistente. Selos com o tempo de uso começam a apresentar vazamentos na bomba por isso devem ser substituídos; • As bolas das válvulas são de rubi aparada em base de safira, formando um selo. •A pressão dentro do reservatório da bomba é a responsável pela abertura e o fechamento do selo. •Bombas Recípocras : Pistão Simples ou Duplo
  105. 105. Pistão Simples Vantagens Geram altas pressões e vazões de volume constante; Compatibilidade com eluição por gradiente e reservatório sem limite de volume (alimentada continuamente pela FM); Desvantagens Sofre cavitação (formação de bolhas durante o movimento dos pistões), devido a compressibilidade dos líquidos; Vazão pulsante e não de forma contínua e uniforme – decorrente do movimento de ida e volta do pistão; Perda na eficiência da coluna e instabilidade do detector – deve usar um amortecedor de pulso.
  106. 106. Pistão Duplo Dois pistões são acionados por um mesmo eixo excêntrico, de forma que, quando um pistão succiona a FM, o outro expulsa o líquido para fora da bomba. Vazão de ambos os pistões, já quase livre de pulsação, é encaminhada à coluna por uma via comum. Sistema de duplo pistão tem todas as vantagens da pistão simples, além da vantagem adicional da grande diminuição do problema de pulsação.
  107. 107. Bombas do Tipo Seringa Chamadas também de êmbolo ou de deslocamento contínuo. Possuem um êmbolo ou pistão que é deslocado de forma contínua e uniforme por um motor de precisão, comprimindo o líquido contido em uma câmara de volume constante. Vantagens –apresenta altas pressões, não apresentam pulsação e possuem fluxo constante da FM. Desvantagem – o reservatório de solvente limitado, o que dificulta o preenchimento e a mudança da FM, pois implica parar o sistema e despressurizar. Poucos instrumentos empregam esse tipo de bomba, devido ao alto custo e as vantagens das bombas recíprocas.
  108. 108. Bombas Pneumáticas •Esta bomba tem um pistão que se movimenta pela ação de agente pneumático. •O reservatório da bomba é cheio pela força do ar comprimido, que desloca o pistão ou diafragma. •As vazões obtidas são livres de pulsações e de pressão constante, isso significa que, se a resistência à pressão da coluna muda, a vazão também muda. •As desvantagens deste sistema são: -Instabilidade na velocidade do fluxo; -Mudanças no tempo de retenção, dificultando a interpretação dos resultados; - Capacidade limitada do volume total que pode ser bombeado.
  109. 109. Cromatografia Líquida Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica). • Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 7.Não destrutivo. 8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
  110. 110. Cromatografia Líquida Detectores • Absorbância • UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105 • IV • Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103 • Índice de refração (universal) – S: 10-7 g/mL – FL: 104
  111. 111. Cromatografia Líquida Detectores • Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. • Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104 • Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
  112. 112. Cromatografia Líquida Detectores • Espectrometria de massa - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. Interface CL-EM
  113. 113. Cromatografia Líquida Detectores • Espectrometria de massa TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TIC SIM
  114. 114. Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
  115. 115. Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa. Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água) FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
  116. 116. Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
  117. 117. Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos
  118. 118. Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. • TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica. • EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
  119. 119. Tabela 1 -Comparação entre as características da CG e CLAE Fator CG CLAE Requisitos para amostra Amostra ou derivado volátil, termicamente estável . Amostra solúvel na fase móvel. Tipos de amostra Gases, líquidos e sólidos; MM – 2 a 1.200 g mol-1 Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes; MM – 32 a 4.000.000 g mol-1 Quantidades mínimas detectáveis 10-10 g a 10-13 g 10-10 g a 10-12 g Tempo de Análise Minutos até uma hora Minutos até poucas horas Números de pratos por coluna 2.000 (recheadas) 50.000 (capilares) 5.000 a 25.000 (recheadas)
  120. 120. Fator CG CLAE Capacidade Preparativa Pobre, necessitando de múltiplas injeções Boa, com facilidade de coleta e capacidade de mecanização; Capacidade Analítica Excelente, separação de amostra com até 200 componentes Excelente, separação com até 100 componentes eum uma amostra Grau de dificuldade e manuseio do equipamento Relativamente fácil Requer maior tempo de treinamento, devido ao conjunto de diferentes modalidades. Além desses parâmetros; CLAE - 2 fases cromatográficas (FE e FM) e CG apenas (FE); Possui maior variedade de FE que atuam em diversos mecanismos de separação; Permite a separação de compostos termicamente instáveis;
  121. 121. CLAE e CG não são Competitivas Duas técnicas se complementam e analisam diferentes tipos de amostras . Vantagens da CLAE Determinação de moléculas de ampla faixa de massas molares; Sensibilidade variando de nanogramas a picogramas; Raramente necessita de derivatização; Pode analisar amostras com n compostos diferentes; Combinação de velocidade, reprodutibilidade e sensibilidade.
  122. 122. Tabela 2- Vantagens e limitações da CLAE Aplicações Análise alimentos, medicamentos, herbicidas, combustíveis, sangue, urina, plantas, etc, com o mínimo de purificação e modificação; Geralmente o único procedimento de amostragem é a ultra- filtração; Pré-concentração da amostra;
  • RosalesRal1

    May. 19, 2021
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